Análise de células-tronco pluripotentes usando criosecções dos corpos embrióides
Summary
Células-tronco pluripotentes de crescimento em suspensão se diferenciar em corpos embrióides (EBs). Aqui demonstramos como obter criosecções de alta qualidade EB útil para estudar os aspectos celulares e moleculares da embriogênese, preservando a sua organização como agregados.
Abstract
-Tronco embrionárias (ES) são células pluripotentes derivadas da massa celular interna do blastocisto estágio precoce de embriões de mamíferos 1. A fase crucial na diferenciação de células-tronco embrionárias é a formação de corpos embrióides (EBs) agregados 2, 3. EB formação é baseada na agregação espontânea, quando as células ES são cultivadas em placas não aderente. Recapitula tridimensional EB muitos aspectos da embriogênese de mamíferos cedo e se diferenciam em três camadas germinativas: ectoderma, mesoderma e endoderma 4.
Imunofluorescência e hibridização in situ são amplamente utilizadas técnicas para a detecção de proteínas-alvo e mRNA presente nas células de uma secção de tecido 5, 6, 7. Aqui nós apresentamos uma técnica simples para gerar criosecções alta qualidade dos corpos embrióides. Esta abordagem baseia-se na orientação espacial do EB incorporação em outubro seguido pela técnica cryosection. As seções resultante pode ser submetida a uma ampla variedade de procedimentos analíticos, a fim de caracterizar as populações de células que contêm certas proteínas, RNA ou DNA. Neste sentido, a preparação da EB criosecções (10μm) são ferramentas essenciais para análise histológica coloração (por exemplo, Hematoxilina e Eosina, DAPI), imunofluorescência (por exemplo, Oct4, nestina) ou hibridização de situ. Esta técnica pode também ajudar a compreender aspectos da embriogênese no que diz respeito à manutenção da estrutura tri-dimensional esférica de EBs.
Protocol
Discussion
O método descrito aqui fornece um fácil de seguir o protocolo para obter PFA seções fixas criostato fina de corpos embrióides útil para imunofluorescência e em ensaios de hibridização in situ. O criosecções resultando permitir o estudo de aspectos celulares e moleculares da embrionárias humanas diferenciação de células-tronco, preservando a sua estrutura e organização como agregados.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo Pesquisa um do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Somos gratos a Bruna Paulsen e S. M. Aline Fernandes para as imagens EB.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | TPP | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
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