خلية كاملة تسجيل النسخة الكالسيوم المنشط الكالسيوم (CRAC) التيارات في الخلايا اللمفية تي الإنسان
Summary
ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لخلية كاملة التصحيح تسجيل المشبك من الكالسيوم النسخة المنشط الكالسيوم (CRAC) التيارات المحيطية في الدم وحيدات النوى الخلية المستمدة اللمفاويات التائية البشرية.
Abstract
في الخلايا اللمفية تي ، واستنزاف الكالسيوم من 2 + 2 + الكالسيوم داخل الخلايا يؤدي إلى تخزين تفعيل البلازمي كا 2 + القنوات ، ودعا الكالسيوم النسخة المنشط الكالسيوم (CRAC) القنوات. قنوات CRAC تلعب دورا هاما في تنظيم تكاثر الخلايا T والتعبير الجيني. وقد تم ربط وظيفة غير طبيعي في خلايا CRAC قناة تي الشديدة للأمراض نقص المناعة والجمع بين الذاتية 1 و 2. قد تدرس CRAC ظيفة القناة في الخلايا التائية البشرية كشف الآليات الجزيئية الجديدة التي تنظم الاستجابات المناعية الطبيعية وكشف عن أسباب الأمراض التي تصيب الإنسان ذات الصلة. تسجيلات للتيارات الكهربية غشاء تقديم تقييم أكثر دقة لخصائص قناة الفنية وتنظيمها. أجري أول تقييم للتيارات الكهربية قناة CRAC في الخلايا التائية Jurkat ، تي سرطان الدم البشري خط خلية ، وأكثر من 20 عاما منذ 3 ، ومع ذلك ، والقياسات الحالية في CRAC العادي الخلايا التائية البشرية يظل مهمة صعبة. ومما يزيد من الصعوبات في تسجيل التيارات قناة CRAC في خلايا T العادية من خلال حقيقة أن الدم المستمدة من الخلايا اللمفية تي هي أصغر بكثير في الحجم من الخلايا التائية Jurkat ، وبالتالي ، فإن التيارات الذاتية CRAC كامل الخلية منخفضة للغاية في السعة. هنا ، فإننا نقدم إجراء خطوة بخطوة التي نستخدمها عادة لتسجيل كا 2 + او + نا التيارات عبر قنوات CRAC يستريح الإنسان في الخلايا التائية المعزولة من الدم المحيطي من المتطوعين الأصحاء. وصف الأسلوب هنا اعتمد من الإجراءات المستخدمة لتسجيل والتيارات CRAC في الخلايا التائية Jurkat وتنشيط خلايا T 4-8.
Protocol
Discussion
التحقيق التيارات الكهربية في CRAC يستريح الإنسان خلايا T هي مهمة صعبة لأن السعة الحالية CRAC الذاتية في هذه الخلايا غير الصغيرة نظرا لحجم خلية صغيرة (الخلايا التائية يستريح الإنسان القطر في حدود 5-8 ميكرومتر). هنا ، نقدم إجراء خطوة بخطوة لتسجيل موثوق بها التيارات CRAC في الخ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لوزارة فسيولوجيا والأغشية علم الأحياء في جامعة كاليفورنيا ديفيس لتزويدنا مرافق وبيئة ممتازة للدراسات القنوات الأيونية.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada | 15061 | ||
| RosetteSep Density Medium | StemCell Technologies | 15705 | ||
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher, Waltham, MA | SH3025501 | ||
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific, Tarzana, CA | FB-01 | ||
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 35050 | ||
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | ||
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | ||
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | ||
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | ||
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | ||
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | ||
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | ||
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | ||
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning, Midland, MI | 3097358-1004 | ||
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning, Midland, MI | |||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA | 63-540 | ||
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments, Bellmore, NY | |||
| Micromanipulator | Sutter Instrument, Novato, CA | MP-285 | ||
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus America, Center Valley, PA | 1X71 | ||
| Windows Computer | Dell | |||
| Pulse software | HEKA Instruments | |||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab, Northampton, MA | |||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument | BF150-110-7.5 | ||
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Los Angeles, CA | MF-830 | ||
| Silicon O-rings | McMASTER-CARR, Santa Fe Springs, CA | 111 S70 | ||
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
References
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan, . Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback. J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms. J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes. J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels. J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).
- Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, . Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells. J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , (1995).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).
