Todo-Cell Gravação de Cálcio O cálcio Release-Ativado (CRAC) Correntes em linfócitos humanos T
Summary
Nós fornecemos um protocolo passo a passo para a gravação de célula inteira patch clamp de Cálcio O cálcio Release-Ativado (CRAC) correntes em sangue periférico mononuclear de células derivadas de linfócitos T humanos.
Abstract
Em linfócitos T, a depleção de Ca 2 + intracelular do Ca 2 + loja leva a ativação de plasmalemmal Ca 2 + canais, chamados de cálcio Release-Activated cálcio (CRAC) canais. CRAC canais desempenham um papel importante na regulação da proliferação de células T e expressão gênica. Função de canal de anormal CRAC nas células T tem sido associada a doenças de imunodeficiência combinada severa e auto-imunes 1, 2. Estudar a função de canal CRAC em células humanas T pode descobrir novos mecanismos moleculares que regulam as respostas imunes normais e desvendar as causas de doenças relacionadas com o humano. Gravações eletrofisiológicas das correntes de membrana uma avaliação mais precisa das propriedades do canal funcional e sua regulamentação. Avaliação eletrofisiológica das correntes CRAC canal em células Jurkat T, um ser humano da leucemia de células T de linha, foi realizado mais de 20 anos atrás 3, no entanto, as medições atuais CRAC em condições normais de células T humanas permanece uma tarefa desafiadora. As dificuldades na gravação correntes canal CRAC em células T normais são agravados pelo fato de que os linfócitos T derivados do sangue são muito menores em tamanho do que as células T Jurkat e, portanto, o endógeno correntes de célula inteira CRAC são muito baixos em amplitude. Aqui, damos um procedimento passo-a-passo que usam rotineiramente para gravar o Ca 2 + ou Na + correntes através de canais CRAC em repouso células T humanas isoladas do sangue periférico de voluntários saudáveis. O método descrito aqui foi adotado a partir dos procedimentos utilizados para a gravação das correntes CRAC em células Jurkat T e ativação de células T humanas 4-8.
Protocol
Discussion
A investigação eletrofisiológicos de correntes CRAC em repouso células T humanas é uma tarefa desafiadora, porque a amplitude CRAC de corrente endógena dessas células é pequeno devido ao tamanho de pequenas células (o diâmetro de células T humanas em repouso está na faixa de 5-8 mm). Aqui, apresentamos um procedimento passo-a-passo para registro confiável correntes CRAC em repouso linfócitos T humanas isoladas a partir de células mononucleares do sangue periférico. Esta tecnologia permite-nos investigar …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos ao Departamento de Fisiologia e Biologia Molecular, Universidade da Califórnia Davis por nos fornecer instalações e um excelente ambiente para os estudos de canais iônicos.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada | 15061 | ||
| RosetteSep Density Medium | StemCell Technologies | 15705 | ||
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher, Waltham, MA | SH3025501 | ||
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific, Tarzana, CA | FB-01 | ||
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 35050 | ||
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | ||
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | ||
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | ||
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | ||
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | ||
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | ||
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | ||
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | ||
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning, Midland, MI | 3097358-1004 | ||
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning, Midland, MI | |||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA | 63-540 | ||
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments, Bellmore, NY | |||
| Micromanipulator | Sutter Instrument, Novato, CA | MP-285 | ||
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus America, Center Valley, PA | 1X71 | ||
| Windows Computer | Dell | |||
| Pulse software | HEKA Instruments | |||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab, Northampton, MA | |||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument | BF150-110-7.5 | ||
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Los Angeles, CA | MF-830 | ||
| Silicon O-rings | McMASTER-CARR, Santa Fe Springs, CA | 111 S70 | ||
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
References
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- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan, . Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
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- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).
