Всего-Cell Запись Кальций Release-активированный кальций (CRAC) Токи в лимфоцитах человека Т
Summary
Мы предоставляем шаг за шагом протокол для цельноклеточной патч зажим записи кальция Release-активированный кальций (CRAC) токов в периферической крови мононуклеарных клеток происхождения человека Т-лимфоцитов.
Abstract
В Т-лимфоциты, истощение Са 2 + из внутриклеточных Са 2 + магазине приводит к активации plasmalemmal Ca 2 + каналы, называемые Кальций Release-активированный кальций (CRAC) каналов. CRAC каналы играют важную роль в регуляции клеточной пролиферации Т и экспрессии генов. Аномальные канал CRAC функции Т-клеток была связана с тяжелым комбинированным иммунодефицитом и аутоиммунных заболеваний, 1, 2. Изучение CRAC функцию канала в человеческих Т-клеток может раскрыть новые молекулярные механизмы, регулирующие нормальный иммунный ответ и раскрыть причины человека, связанных с заболеваниями. Электрофизиологические записи мембранных токов обеспечивают наиболее точную оценку функциональных свойств канала и их регулирование. Электрофизиологические оценки CRAC токов канала в Jurkat Т-клетки, лейкемии человека Т-клеток линии, была впервые исполнена более чем 20 лет назад 3, однако, CRAC измерения тока в нормальных человеческих Т-клеток остается сложной задачей. Трудности в записи токов CRAC канала в нормальных клетках Т усугубляется тем, что кровь полученных Т-лимфоцитов значительно меньше по размеру, чем Jurkat Т-клеток и, таким образом, эндогенные цельноклеточная токов CRAC очень низкие по амплитуде. Здесь мы даем шаг за шагом процедуры, которые мы обычно используем для записи Са 2 + и Na + токи через CRAC каналов в состоянии покоя человека Т-клеток выделенных из периферической крови здоровых добровольцев. Метод, описанный здесь, был принят от процедур, используемых для записи CRAC токов в Jurkat Т-клеток и активированных Т-клетках человека 4-8.
Protocol
Discussion
Электрофизиологические исследования CRAC токи в состоянии покоя человека Т-клеток является сложной задачей, поскольку эндогенный CRAC амплитуды тока в этих клетках мало из-за небольшого размера ячейки (отдыха человека Т-клеток диаметром в диапазоне 5-8 мкм). Здесь мы представляем шаг за ша?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны кафедры физиологии и мембранной биологии Калифорнийского университета Дэвиса за предоставление нам помещения и отличные условия для исследования ионных каналов.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada | 15061 | ||
| RosetteSep Density Medium | StemCell Technologies | 15705 | ||
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher, Waltham, MA | SH3025501 | ||
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific, Tarzana, CA | FB-01 | ||
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 35050 | ||
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | ||
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | ||
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | ||
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | ||
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | ||
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | ||
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | ||
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | ||
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning, Midland, MI | 3097358-1004 | ||
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning, Midland, MI | |||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA | 63-540 | ||
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments, Bellmore, NY | |||
| Micromanipulator | Sutter Instrument, Novato, CA | MP-285 | ||
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus America, Center Valley, PA | 1X71 | ||
| Windows Computer | Dell | |||
| Pulse software | HEKA Instruments | |||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab, Northampton, MA | |||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument | BF150-110-7.5 | ||
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Los Angeles, CA | MF-830 | ||
| Silicon O-rings | McMASTER-CARR, Santa Fe Springs, CA | 111 S70 | ||
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
References
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan, . Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback. J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms. J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes. J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels. J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).
- Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, . Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells. J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , (1995).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).
