In vivo e in vitro di adattatore-clatrina Interazione
Summary
Clatrina endocitosi mediata dipende da proteine adattatrici che coordinano la selezione delle merci e montaggio cappotto clatrina. Qui si descrivono le modalità di studio adattatore clatrina interazione fisica e l'imaging di cellule in vivo approcci utilizzando come modello il lievito endocitico Sla1p proteina adattatore.
Abstract
Un percorso importante endocitico inizia con la formazione di vescicole rivestite clatrina (CCV), che il trasporto merci dalla superficie cellulare di endosomi 1-6. CCV sono caratterizzati da un reticolo poliedrico di clatrina che ricopre la membrana delle vescicole e serve come un dispositivo meccanico patibolo. Cappotti clatrina sono assemblati durante la formazione delle vescicole da individuo clatrina triskelia, la forma solubile di clatrina composta da tre subunità luce pesanti e tre catene 7,8. Poiché il triscele non ha la capacità di legarsi alla membrana direttamente, clatrina vincolante adattatori sono fondamentali per collegare il reticolo che formano clatrina alla membrana attraverso l'associazione con i lipidi e / o di proteine di membrana 9. Adattatori anche il pacchetto di proteine transmembrana carico, come i recettori, e possono interagire tra loro e con altri componenti della formazione CCV macchinari 9.
Oltre venti adattatori clatrina sono stati descritti, molti sono coinvolti in clatrina endocitosi mediata e altri localizzare al Golgi trans rete o endosomi 9. Con l'eccezione di HIP1R (lievito Sla2p), tutte le schede noto clatrina legarsi al N-terminale-elica dominio della catena clatrina pesante 9. Adattatori clatrina sono proteine modulare composto da domini piegato collegati da non strutturati linker flessibile. All'interno di queste regioni linker, brevi motivi vincolanti mediare le interazioni con la clatrina dominio N-terminale o altri componenti della formazione di vescicole macchinari 9. Due distinti clatrina vincolanti motivi sono stati definiti: la clatrina-box e il W-box 9. La clatrina-box sequenza consenso è stato originariamente definito come L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10 varianti, ma sono stati successivamente scoperti 11. Il W-box è conforme al PWxxW sequenza (dove x è qualsiasi residuo).
Sla1p (letale sintetico con Actina binding protein-1) è stato originariamente identificato come una proteina actina associata ed è necessaria per la normale struttura del citoscheletro di actina e le dinamiche in siti endocitico in cellule di lievito 12. Sla1p si lega anche il segnale NPFxD ordinamento endocitico ed è fondamentale per endocitosi di carico porta il segnale NPFxD 13,14. Più recentemente, è stato dimostrato Sla1p legare clatrina attraverso un motivo simile alla finestra di clatrina, LLDLQ, definita una variante clatrina-box (VCB), e di funzionare come un adattatore endocitico clatrina 15. Inoltre, Sla1p è diventato un indicatore ampiamente usato per il cappotto endocitico negli studi di microscopia a fluorescenza delle cellule vive 16. Qui usiamo Sla1p come modello per descrivere approcci per l'adattatore-clatrina studi di interazione. Ci concentriamo sulla microscopia a fluorescenza delle cellule vive, GST-pull down, e co-immunoprecipitazione metodi.
Protocol
Discussion
Clatrina rivestite vescicole (CCV) partecipare endocitosi e trasporto dal trans Golgi rete e endosomi, percorsi conservate che sono fondamentali per la biologia delle cellule eucariotiche. Gli approcci descritti in questo documento i metodi sono utili per studiare i meccanismi molecolari responsabili della formazione CCV, in particolare le interazioni tra proteine adattatore e clatrina. GST-fusione affinità proteine e co-immunoprecipitazione test permettono di prova per l'associazione fisica tr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DF è supportato da una Bridges NSF per la borsa di dottorato. Il microscopio utilizzato in questo lavoro è sostenuto in parte dal Microscope Imaging infrastrutture di rete core di concedere Colorado State University. Il lavoro sugli adattatori clatrina in laboratorio l'autore s è supportato da CSU start-up e fondi americani premio Heart Association 09SDG2280525 a SD
Materials
| Material | Company |
|---|---|
| QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit | Stratagene |
| protease inhibitor cocktail | Sigma |
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