In vivo och in vitro studier av Adapter-clathrin Interaktion
Summary
Clathrin-medierad endocytos beror på adaptern proteiner som samordnar gods urval och clathrin päls montering. Här beskriver vi rutiner för att studera adapter-clathrin fysisk interaktion och levande cell imaging tillvägagångssätt med som en modell jästen endocytic Sla1p adapter protein.
Abstract
En stor endocytic bana inleder med bildandet av clathrin belagda vesiklar (CCVs) att transportera gods från cellytan till endosomes 1-6. CCVs kännetecknas av en polyhedral galler av clathrin som rockar vesikler membranet och fungerar som en mekanisk klätterställning. Clathrin skikt monteras under vesikler bildning från enskilda clathrin triskelia, den lösliga formen av clathrin består av tre tunga och tre subenheter lätt kedja 7,8. Eftersom triskelion inte har förmåga att binda till membranet direkt clathrin bindande adaptrar är avgörande för att länka bilda clathrin gitter till membranet genom samarbete med lipider och / eller membranproteiner 9. Adaptrar även paket transmembrana protein gods, såsom receptorer, och kan interagera med varandra och med andra delar av CCV bildandet maskiner 9.
Över tjugo clathrin adaptrar har beskrivits, flera är inblandade i clathrin endocytos och andra lokalisera till trans Golgi nätverket eller endosomes 9. Med undantag av HIP1R (jäst Sla2p), alla kända clathrin adaptrar binder till N-terminal-propeller domän clathrin tunga kedjan 9. Clathrin adaptrar är modulära protein bestående av vikta domäner sammankopplade med ostrukturerad flexibel linkers. Inom dessa linker regioner, kort bindande motiv medla interaktion med clathrin N-terminal domän eller andra delar av vesikler bildning maskiner 9. Två skilda clathrin-bindande motiv har definierats: den clathrin box och W-ruta 9. Samförståndet clathrin-box-sekvensen definierades ursprungligen som L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10, men varianter har därefter upptäckt 11. W-boxen följer sekvensen PWxxW (där x är några rester).
Sla1p (Syntetiska Lethal med aktin bindande protein-1) var ursprungligen identifierats som en associerad aktin protein och är nödvändig för normal aktin cytoskelettet struktur och dynamik i endocytic platser i jästceller 12. Sla1p binder också NPFxD endocytic sortering signal och är kritiskt för endocytos av last som bär NPFxD signalen 13,14. Mer nyligen var Sla1p visat att binda clathrin genom ett motiv som liknar den clathrin rutan LLDLQ, kallas en variant clathrin-box (VCB), och att fungera som en endocytic clathrin adapter 15. Dessutom har Sla1p blivit ett vanligt förekommande markör för endocytic pälsen i levande mikroskopi cell fluorescens studier 16. Här använder vi Sla1p som en modell för att beskriva metoder för adapter-clathrin interaktionsstudier. Vi fokuserar på levande celler fluorescensmikroskopi, GST-pull down, och co-immunoprecipitation metoder.
Protocol
Discussion
Clathrin belagda vesiklar (CCV) delta i endocytos och transport från trans Golgi nätverket och endosomes, bevarade vägar som är grundläggande för eukaryota cellbiologi. De metoder som beskrivs i denna metoder papper är bra att studera de molekylära mekanismer som CCV bildning, särskilt samspelet mellan adapter proteiner och clathrin. GST-fusionsprotein samhörighet och samarbete immunoprecipitation analyser möjliggör testning av fysiska samband mellan en adapter (kandidat) och clathrin. GFP-taggning …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DF stöds av en NSF Broar till doktorsexamen gemenskap. Mikroskopet som används i detta arbete stöds delvis av Mikroskop Imaging Network kärninfrastruktur bidrag från Colorado State University. Arbetet med clathrin adaptrar i författarens laboratorium stöds av CSU starta fonder och American Heart Association utmärkelse 09SDG2280525 till SD
Materials
| Material | Company |
|---|---|
| QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit | Stratagene |
| protease inhibitor cocktail | Sigma |
References
- Mellman, I., Warren, G. The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell. 100, 99-112 (2000).
- Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Bonifacino, J. S., Traub, L. M. Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes. Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).
- Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding. Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Kirchhausen, T. Clathrin. Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).
- Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).
- Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. Adaptors for clathrin coats: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).
- Dell’Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin. Science. 280, 431-434 (1998).
- Dell’Angelica, E. C. Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network!. Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).
- Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).
- Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis. J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).
- Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i., Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif. EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).
- Pietro, S. M. D. i., Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain. EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123, 305-320 (2005).
- Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14, 953-9561 (1998).
- Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, 1065-1075 (1997).
- Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases. Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Génétique. 122, 19-27 (1989).
- Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor. Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).
