Clathrine endocytose dépend de protéines adaptatrices qui coordonnent la sélection de fret et de l'assemblage manteau de clathrine. Nous décrivons ici les procédures pour étudier l'adaptateur clathrine interaction physique et imagerie des cellules vivantes approches utilisant comme modèle la levure Sla1p endocytose protéine adaptatrice.
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Article de méthode
In vivo et in vitro de l'adaptateur-clathrine Interaction
Dans cet article
Résumé
Résumé
Une importante voie endocytaire initie avec la formation de vésicules recouvertes de clathrine (CCV) que les cargaisons de transport de la surface de la cellule vers les endosomes 1-6. CCVS sont distingués par un treillis polyédriques de la clathrine qui recouvre la membrane de la vésicule et sert mécaniques échafaud. Manteaux de clathrine sont assemblés lors de la formation des vésicules de clathrine triskelia individuelles, la forme soluble de la clathrine composée de trois lourdes et trois sous-unités de la chaîne légère 7,8. Parce que le triskelion n'a pas la capacité de se lier à la membrane directement, la clathrine contraignante adaptateurs sont indispensables pour relier le réseau formant la clathrine à la membrane par l'association avec les lipides et / ou protéines de la membrane 9. Adaptateurs également des marchandises protéines transmembranaires emballage, tels que des récepteurs, et peuvent interagir les uns avec les autres et avec les autres composantes de la formation CCV machines 9.
Plus de vingt adaptateurs de clathrine ont été décrites, plusieurs sont impliqués dans l'endocytose médiée clathrine et d'autres localiser dans le réseau trans de Golgi ou les endosomes 9. À l'exception de HIP1R (levure Sla2p), toutes les cartes connues clathrine se lier au domaine N-terminal-hélice de la chaîne lourde clathrine 9. Adaptateurs de clathrine sont des protéines modulaires constitués de domaines reliés par replié non structurées lieurs. Dans ces régions linker, courts motifs de liaison avec la médiation des interactions clathrine domaine N-terminal ou d'autres composantes de la formation des vésicules machines 9. Deux distinctes clathrine motifs de liaison ont été définis: la boîte clathrine et le W-box 9. Le consensus de clathrine boîte de séquence a été initialement défini comme L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10, mais des variantes ont été découvert par la suite 11. Le W-box est conforme à la séquence PWxxW (où x est un résidu).
Sla1p (synthétique létale avec l'actine binding protein-1) a été initialement identifié comme une protéine actine associé et est nécessaire pour la structure normale cytosquelette d'actine et la dynamique des sites endocytose dans les cellules de levure 12. Sla1p lie également le signal de tri NPFxD endocytose et est essentielle pour l'endocytose des marchandises portant le signal de NPFxD 13,14. Plus récemment, Sla1p a été démontré pour lier la clathrine par un motif similaire à la boîte de clathrine, LLDLQ, appelée variante de la clathrine boîte (VCB), et de fonctionner comme un adaptateur endocytose clathrine 15. En outre, Sla1p est devenu un marqueur couramment utilisé pour la couche endocytose dans les études de cellules vivantes de microscopie par fluorescence 16. Ici, nous utilisons Sla1p comme un modèle pour décrire les approches pour les études d'interaction adaptateur clathrine. Nous nous concentrons sur la microscopie à fluorescence des cellules vivantes, GST-pull down, et co-immunoprécipitation méthodes.
Protocole
1. L'incorporation d'une balise de la GFP et marqueur de sélection dans le gène SLA1
Appliquer la méthode Longtine 17 afin de fusionner une étiquette GFP directement à l'extrémité 3 'du cadre ouvert de lecture du gène SLA1 (Sla1p C-terminale) et simultanément marquer le gène avec les E. coli Kanr gène qui permet la sélection G418.
- Générer un fragment d'ADN par PCR en utilisant comme modèle le plasmide pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 18 et les amorces suivantes: avant, 5'-CA AGG CAA CCG AAC ATA TTC AAT GCT LOI GCA ACT AAT GCC TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3 ', et renverser, 5'....
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Discussion
Clathrine vésicules (CCV) de participer à l'endocytose et le transport à partir du réseau trans de Golgi et les endosomes, les voies qui sont conservés à la biologie fondamentale des cellules eucaryotes. Les approches décrites dans cet article les méthodes sont utiles pour étudier les mécanismes moléculaires responsables de la formation CCV, dans les interactions entre les protéines notamment adaptateur et la clathrine. L'affinité des protéines de fusion GST et de co-immunoprécipitation permettent de te.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
DF est soutenu par une Ponts NSF pour la bourse de doctorat. Le microscope utilisé dans ce travail est soutenu en partie par le microscope Imaging Network subvention d'infrastructure de base du Colorado State University. Les travaux sur les adaptateurs de clathrine dans le laboratoire de l'auteur est soutenue par la CSU fonds de démarrage et de prix de l'American Heart Association 09SDG2280525 à SD
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Matériaux
| Matériau | Société | ||
|---|---|---|---|
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
| QuickChange-XL mutagenèse dirigée kit | Stratagene | ||
| Cocktail inhibiteur de protéase | Sigma |
Références
- Mellman, I., Warren, G. The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell. 100, 99-112 (2000).
- Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).
- C....
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Réimpressions et autorisations
