In vivo und in vitro Studien zur Adapter-Clathrin Interaction
Summary
Clathrin-vermittelte Endozytose hängt Adapter Proteine, die Fracht Auswahl und Clathrin-Mantel Montage zu koordinieren. Hier beschreiben wir Verfahren, die Adapter-Clathrin physikalische Interaktion und Live Cell Imaging Ansätze benutzt als Modell die Hefe endocytischen Adapter-Protein Sla1p studieren.
Abstract
Ein großer endocytischen initiiert mit der Bildung von Clathrin-coated Vesikel (CCVS), dass der Transport Fracht von der Zelloberfläche bis 1-6 Endosomen. CCVs sind durch eine polyedrische Gitter Clathrin, dass Coats die Vesikelmembran aus und dient als mechanischer Gerüst. Clathrin Mäntel sind während der Vesikelbildung aus einzelnen Clathrin triskelia, die lösliche Form von Clathrin von drei schweren und drei leichten Kette Untereinheiten zusammengesetzt 7,8 montiert. Da die triskelion nicht über die Fähigkeit, sich an die Membran direkt zu binden, sind Clathrin-bindenden Adapter entscheidend für die Bildung von Clathrin Gitter an der Membran Link durch die Verbindung mit Lipiden und / oder Membranproteine 9. Adapter auch Paket Transmembranprotein Fracht, wie Rezeptoren und können untereinander und mit anderen Komponenten des CCV-Maschinerie 9 interagieren.
Über zwanzig Clathrin-Adapter sind beschrieben worden, mehrere sind in der Clathrin vermittelten Endozytose beteiligt und andere lokalisieren, die trans-Golgi-Netzwerk oder Endosomen 9. Mit Ausnahme der HIP1R (Hefe Sla2p), binden alle bekannten Clathrin-Adapter auf die N-terminal-Propeller-Domäne des Clathrin schwere Kette 9. Clathrin-Adapter sind modular Proteinen bestehend aus gefalteten Domänen von unstrukturierten flexible Linker verbunden. Innerhalb dieser Linker Regionen, vermitteln kurze Bindungsmotive Interaktionen mit dem Clathrin N-terminalen Domäne oder andere Komponenten des Vesikelbildung Maschinen 9. Zwei verschiedene Clathrin-bindenden Motive wurden definiert: die Clathrin-Box und die W-Box-9. Der Konsens Clathrin-Box-Sequenz wurde ursprünglich definiert als L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10, aber Varianten wurden anschließend 11 entdeckt. Das W-Feld entspricht der Reihenfolge PWxxW (wobei x jede Rückstand).
Sla1p (Synthetic Lethal mit Actin bindendes Protein-1) wurde ursprünglich als ein Aktin-assoziierten Protein identifiziert und ist notwendig für den normalen Aktin-Zytoskelett Struktur und Dynamik bei endocytischen Standorten in Hefezellen 12. Sla1p bindet auch die NPFxD endocytischen Sortierung Signal und ist entscheidend für die Endozytose von Fracht mit der NPFxD Signal 13,14. In jüngerer Zeit Sla1p Es wurde gezeigt, binden durch ein Motiv ähnlich wie die Clathrin Box, LLDLQ Clathrin, bezeichnet eine Variante Clathrin-box (VCB), und als endocytischen Clathrin Adapter 15-Funktion. Darüber hinaus hat Sla1p zu einem weit verbreiteten Marker für die endocytischen Mantel in lebenden Zellen Fluoreszenz-Mikroskopie Studien 16. Hier verwenden wir Sla1p als Modell, Ansätze für Adapter-Clathrin Studien zu Wechselwirkungen zu beschreiben. Wir konzentrieren uns auf Live-Cell-Fluoreszenz-Mikroskopie, GST-Pull-Down-und Co-Immunopräzipitation Methoden.
Protocol
Discussion
Clathrin-beschichteten Vesikeln (CCV) in Endozytose und Transport vom trans-Golgi-Netzwerk zu beteiligen und Endosomen, konservierte Signalwege, die von grundlegender Bedeutung für eukaryotischen Zelle Biologie. Die Ansätze in diesem Papier beschrieben Methoden sind nützlich, um die molekularen Mechanismen, die für CCV Bildung, insbesondere Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Adapter Clathrin zu studieren. GST-Fusionsprotein Affinität und Co-Immunopräzipitation Assays erlauben Prüfung der physikalisc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DF wird von einem NSF Brücken in die Promotion Stipendium gefördert. Das Mikroskop in dieser Arbeit verwendet wird teilweise durch das Mikroskop Imaging Network Kerninfrastruktur Zuschuss von der Colorado State University unterstützt. Die Arbeiten an Clathrin-Adapter in Laboratorium des Autors wird von CSU Start-up-Fonds und der American Heart Association ausgezeichnet 09SDG2280525 auf SD unterstützt
Materials
| Material | Company |
|---|---|
| QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit | Stratagene |
| protease inhibitor cocktail | Sigma |
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