Följande protokoll är skriven för produktion och användning av en ATS bygger på Sindbis viruset MRE16. ATS är utformad för att uttrycka GFP i mygga vektor Aedes aegypti. cDNA Smittsamma kloner av ett antal alphaviruses (Sindbis virus, Chikungunya virus, O'nyong-nyong virus, västra hästencefalitvirus virus) är för närvarande tillgängliga som har utformats som ATS: s (tabell 1). För bästa resultat plasmid-DNA förstärks i bakterier som SURE behöriga bakterier (Stratagene / Agilent Technologies) för att undvika oönskade rekombination och förlust av viralt cDNA. Alla smittsamma klon plasmider har en bakteriofag T7 eller SP6 promotorn på omedelbar 5 "slutet av virala cDNA för transkription av full längd genomiska RNA och en unik begränsning endonuclease vid 3" slutet för avrinning transkription. För varje ATS måste användarna använda rätt bakteriofag DNA-beroende RNA-polymeras och unika begränsning endonuclease för in vitro transkription av viralt RNA-genom. 1. Generation av infektiös RNA från cDNA klon. Linjärisera den 5 mikrogram av den smittsamma klon plasmiden (p5'dsMRE16 / GFP) med 20 enheter XhoI restriktionsenzymanalys i en 100 mikroliter reaktion. Inkubera i 2-3h vid 37 ° C Rena linjäriserade DNA med Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit alternativa rening protokoll eluerande DNA från spinn kolumn med 50 mikroliter RNase-fritt vatten. Plasmid koncentration bör vara ungefär 1,0 mikrogram / mikroliter. I en RNas-fri 0,2 ml PCR-rör, set-up en 50 mikroliter transkription reaktion med Ambion MAXIscript Kit per protokoll enligt följande. 22,5 mikroliter RNas-fria dH 2 O 5,0 mikroliter Linjäriserad DNA-mall (1,0 mikrogram / l) 2,5 mikroliter 10 mM ATP 2,5 mikroliter 10 mM CTP 2,5 mikroliter 10 mM UTP 2,5 mikroliter 1mm GTP 2,5 mikroliter 10 mM cap analoga (m 7 G (5) PPP (5 ') G) 5,0 mikroliter 10X transkription buffert 5,0 mikroliter T7 eller SP6 polymeras mix 50,0 mikroliter Totalt Inkubera transkription reaktionen för 1 timme vid 37 ° C. Efter inkubation, bör reaktionen användas omedelbart för elektroporering av BHK-21 celler. Beredning av BHK-21 celler för elektroporation bör inledas under inkubationstiden transkription reaktion. 2. Generation av virus från Smittsamma RNA Trypsinize två 70-80% konfluenta 150 cm 2 (T-150) kolv BHK-21 celler per ATS. Överför alla celler till ett 15 ml koniskt centrifugrör. Pellets cellerna genom centrifugering vid 2000 rpm, 10 min, 4 ° C i en vanlig bordsskiva centrifug. Resuspendera cellerna i sterila PBS utan Mg + + och Ca + +. Upprepa steg 2,3 och 2,4 tills celler har sköljs tre gånger med PBS. Resuspendera pelleterat cellerna 0,5 ml MEM innehåller 10% FBS. Späd 10 mikroliter celler med 90 mikroliter MEM med 10% FBS och räkna med en hemacytometer. Om nödvändigt, späd celler till 2,5-12,5 x 10 7 celler / ml med MEM innehåller 10% FBS. För att en iskall 0,2 cm elektroporation kyvett, tillsätt 400 mikroliter cellsuspension och 20 mikroliter transkription reaktion. Torka kondens kyvett. Puls kyvetten två gånger: 450V, 1200Ω, 150 uF. Vi använder en Electro Cell Manipulator, Harvard Apparatus modell ECM630. Placera hela innehållet i kyvetten i en 25 cm 2 vävnadsodling kolven som innehåller 5 ml MEM med 10% FBS. Inkubera kolv (s) vid 37C med 5% CO 2. Övervaka infektionen dagligen med ett inverterat fluorescerande mikroskop med lämpligt filter in (t.ex. GFP filter: excitationsvåglängden = 460-490 nm, emission våglängd = 510-550 nm, eller dsRed filter: excitationsvåglängden = 460-560 nm, emission våglängd => 590 nm). När fluorescens tyder på infektion är konfluenta och / eller CPE är synlig i hela kolven, samla innehållet i kolven, tillsätt 30% FBS, uppmätt vid behov, och förvara vid -80 ° C. Om så önskas kan cellen lysates tas bort genom centrifugering (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) före tillägg av FBS. Passage virus minst en gång genom en ny kolv av celler för att öka virus titer för senare analyser blod utfodring. 3. Per os Infektion av myggor Blanda samman blod (oftast köps de-fibrinated får blodet) och cellodling härrör virussuspension från steg 2,13. Final virus titer i blodet måltiden normalt bör vara ~ 1×10 7 plack bildas enheter (PFU) / ml för effektiv midgut infektion i mygga. För att stimulera myggor att uppsluka, adenosin 5'-trifosfat (ATP) kan läggas till en slutlig koncentration av 0.02M. Myggor kanmåste berövas vatten och socker innan infektionen att stimulera dem att effektivt blod foder från en artificiell mataren. Varaktighet av fattigdom bör tidigare fastställda för att minimera dödligheten. Gånger beror på myggarter, fuktighet insectary etc. Som en utgångspunkt, ta bort socker 24h och 12h vatten före fodret. Detta protokoll använder vattenmantlad glas feeders17 med cirkulerande 37 ° C vatten. Ett svin intestinal membran (dvs. noggrant tvättas korv hölje finns på de flesta livsmedelsbutiker) placeras över mynningen av mataren och måltiden är pipetteras till kammaren. Olika utföranden, membran och protokoll finns för olika vektor typer. Myggor sorteras väljer endast de myggor svullna av blod. Svullna myggor överförs till en kartong med organdi på toppen och myggorna inkuberas vid 28 ° C, 75-80% relativ luftfuktighet tills behandlas för GFP uttryck. 4. Intratorakalt Inokulering av myggor Intratorakalt inympning är en alternativ metod för att angripa de leddjur. Denna metod används när spridning genom att midgut inte behövs. (Metod som beskrivs nedan men tekniken är inte visas i denna visuella experiment). Ett litet antal myggor (5-10) sugs från anläggningen burar i plast håller rör. Den förseglade hålla Rören kommer att placeras vid 4 ° C i 15 minuter för att kyla myggor. 2 5 myggor kommer att spillas ur tuben på ett glas petriskål vilar på isen. Placera locket på petriskålen när den inte används eller om myggorna börjar att flytta runt. Under hanteringen av myggor, måste man räkna och hålla koll på antalet myggor manipuleras. Som myggor spills på kylan bordet, kommer det totala antalet spelas in på ett lab disk. Nålen är beredd genom smältning kapillär slang med Nanoject specifika glas och en nål avdragare. Ställ in Nanoject II microinjector per tillverkarens anvisningar för leverans av 69 nL inokulat. Försiktighet måste iakttas vid utarbetandet av inokulatet in nålen så att nålen inte är skadad. Med hjälp av en dissekera mikroskop, för in nålen i bröstkorgen av mygg och aktivera Nanoject för ympning. Försiktighet måste iakttas vid inokulering av myggor, så att nålen inte helt tränga in i myggans och avsluta den andra sidan, vilket resulterar i den efterföljande död mygga. Kontrollera varje mygga att vara säker på att inokulatet in innan du tar bort det från injektionsnålen. Efter vaccinationen, medan mygga fortfarande spetsas på nålen, placera den i ett papper att hålla kartong genom ett litet hål i sidan som är ansluten med bomull eller en kork vid alla andra tillfällen. När myggorna har inokulerade och placeras i kartong (upp till cirka 50 per kartong), försiktigt tejpen korken för att förhindra oavsiktliga utsläpp av myggor. Placera kartonger på ett säkert hålla bin innan ytterligare inkubering i insectary vid 28 ° C och 80% relativ fuktighet. 5. Övervakning Infektion av myggor Placera papperet håller kartongen vid 4 ° C i ca 15 minuter att immobilisera myggor. Överför ett litet antal myggor (5-10 i taget) till en kyla bord anpassat för användning på en fluorescerande mikroskop. Undersök och sortera mygg baserade på närvaro eller frånvaro av fluorescens. Dessutom kan fluorescerande intensitet användas som en proxy kvantitativ mätning av infektion. Mosquito vävnader som midguts, spottkörtlar, kan fett kropp dissekeras och övervakas för fluorescens. Om det är lämpligt, återvänder utvalda myggor till papper kartong för att fortsätta inkubation av infekterade myggor. 6. Transmission-analys (Tvingad Salivation att demonstrera virusöverföring) Beröva myggor av socker källa för 24 timmar före foder. Ta bort ben och vingar Att en 50 mikroliter kapillärrör som har uppvärmd, dras och klippt i ena änden, lägg 3-5 mikroliter av Cargille typ B immersionsolja eller 10% serum-sackaroslösning. Sätt in snabel i röret. Om du använder olja, kommer droppar av saliv ses att andas från snabel. En mikroliter av en 1% pilocarbine lösning i PBS och 0,1% Tween 80 kan tillämpas på bröstkorgen för att stimulera. Efter 60-90 minuter, ta bort myggor och lagra för virusisolering vid behov. Ta bort lösning från röret genom centrifugering i en tub som innehåller 100 mikroliter 20% FBS-PBS. Sterila filtrera inokulat genom ett 0,2 ìm spruta filtret och sedan använda den filtrerade inokulatet att infektera odlade celler. Biosäkerhet OBS: Detta protokoll beskriveren metod för att generera, identifiera och övervakning infekterade myggor. Baserat på dina anläggningar (dvs. en chill bord, inneslutning anläggning, etc.) och IBC godkännande, kan du vara begränsad till att granska dem först ta bort vingar och ben för att förhindra flykt. SINV-baserade ATS är kan genereras och användas i en BSL2 miljö. Användningen av ATS är baserad på andra alphaviruses som Chikungunya virus eller western häst virus encefalit kräver BSL3 anläggningar. 7. Representativa resultat En översikt av uttrycket av en markör gen (GFP) med ATS 5'dsMRE16 / GFP visas i figur 1. Redovisning av GFP i BHK-21 och C6/36 (Aedes albopictus) celler visas i Figur 2 på bestämda tider efter infektion av celler med 5'dsMRE16 / GFP virus på 0,01 mångfald av infektion. Figur 3 är en översikt över alfaviruset och ATS-virusinfektion i mygga när viruset levereras genom ett smittsamt blodmjöl. Figur 4 visar förbereda en blodmjöl med ~ 10 7 PFU / ml ATS virus följt av oral infektion i Aedes aegypti. Hela kroppen bakgrund av infekterade myggor och valda kroppsdelar på 10 dagar efter infektion med en epifluorescensmikroskop (Figur 5). Upptäckt av GFP och dsRED i midguts av infekterade myggor efter infektion med ATS 5'dsMRE16 virus som uttrycker varje fluorescerande markör genen (Figur 6). Överföring analysen med myggor infekterade med 5'dsMRE16 / GFP ATS-virus (Figur 7). Tabell 1. ATS är för närvarande konstruerats för genuttryck i myggor. Alfaviruset ATS Mosquito Referens Sindbis Virus TE / 3'2J och TE / 5'2J Aedes aegypti 12 Ochlerotatus triseriatus 13 3'dsMRE16 och 5'dsMRE16 A. aegypti 5 Culex tritaeniorhynchus 5 5'dsTR339 A. AEG ypti 2 Chikungunya virus 3'dsCHIKV och 5'dsCHIKV A. aegypti / A. albopictus 20 O'nyong nyong virus 5'dsONNV Anopheles gambiae 1,9 Western hästencefalitvirus virus 5'dsWEEV. McMillan Culex tarsalis Stauft et al. Opublicerad Tabell 2. Fördelar / nackdelar med att använda ATS är för genuttryck i myggor. Fördelar: Snabb produktion av hög-titer virus Brett spektrum av värdorganismer (SINV) Hög RNA replikering takt Höga transgenen uttryck nivåer Relativt lätt att manipulera gener Stabil, ihållande genuttryck hos insekter Minimal patologi hos insekter Nackdelar: Kortsiktiga uttryck läge i ryggradsdjur celler Starka cytopatisk effekter på ryggradsdjur celler Gene storlek begränsningar (<1Kb, helst) Vissa alphaviruses kräver BSL3 inneslutning Figur 1: Översikt av ATS-virus produktion i BHK-21 celler med p5'dsMRE / GFP SINV uttrycka GFP. Efter in vitro transkription är genomisk ATS RNA electroporated i BHK-21 celler där viruset är räddad. ATS Viruset kan sedan användas för att infektera myggor. STP = subgenomic promotor. Tre ATS-RNA arter transkriberas i CELLS, den genomiska, subgenomic 1 och subgenomic 2 RNA. C (kapsid), är E2 och E1 glykoproteiner monterad med ATS genomet för att generera smittsamt virus. Figur 2: Redovisning av GFP i mygga (C6/36) celler efter infektion med SINV 5'dsMRE16 / GFP viruset. Figur 3: Översikt över ett ATS-virusinfektion i myggor som leder till virusöverföring. Figur 4: ATS SINV 5'dsMRE16 infektion genom att utsätta myggor till en smittsam blodmjöl. Figur 5: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP infektion vid 10 dagar efter infektion. Hela kroppen upptäckt av GFP visar att viruset har undgått midgut och spridas till sekundära vävnader. Figuren visar också GFP uttryck i utvalda kroppsdelar som också är ett tecken på en disseminerad infektion. Figur 6: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP och 5'dsMRE16 / dsRED infektion midguts på bestämda tider efter infektion. Midguts brukar ha olika fokus för infektion tidigt efter intag av en blodmjöl som innehåller virus som sprider sig i hela bakre midgut på senare tid efter infektion. Figur 7: Upptäckt av ATS 5'dsMRE16 / GFP i myggans saliv så tidigt som 8 dagar efter infektion. Testet är designat för att visa överföring av ATS virus och visar att 5'dsMRE16 / GFP viruset stabilt kan uttrycka GFP hela yttre inkubationstid i mygga. Den vänstra panelen visar en mygga dregla i ett kapillärrör, visar mittpanelen C6/36 celler infekterade med saliv på en dag och högra panelen 3 dagar efter infektion.