Protocole pour la production d'un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

Summary

Croisements génétiques des parasites du paludisme chez les rongeurs sont effectuées en alimentant deux des parasites génétiquement distinctes pour les moustiques. Recombinant progéniture clonée à partir de sang de souris après avoir laissé les moustiques de mordre des souris infectées. Cette vidéo montre comment produire des croisements génétiques<em> Plasmodium yoelii</em> Et est applicable à d'autres parasites du paludisme chez les rongeurs.

Abstract

Variation de la réponse aux médicaments antipaludiques et dans la pathogénicité des parasites du paludisme est de l'importance biologique et médicale. Cartographie de liaison a conduit à l'identification réussie de gènes ou loci sous différents traits de parasites du paludisme des rongeurs ^1-3 et humains ^4-6. Le parasite du paludisme Plasmodium yoelii est l'une des nombreuses espèces de paludisme isolé de rongeurs africains sauvages et a été adapté à croître dans les laboratoires. Cette espèce se reproduit de nombreuses caractéristiques biologiques des parasites du paludisme humain; marqueurs génétiques tels que des microsatellites et amplifié fragment length polymorphism (AFLP) ont également été développés pour le parasite ^7-9. Ainsi, les études génétiques des parasites du paludisme des rongeurs peuvent être effectués pour compléter les recherches sur Plasmodium falciparum. Ici, nous montrons les techniques de production d'un croisement génétique de P. yoelii qui ont d'abord mis au point par les Drs. David Walliker, Richard Carter, et ses collègues de l'Université d'Edimbourg ^10.

Croisements génétiques de P. yoelii et autres parasites du paludisme chez les rongeurs sont menées en infectant les souris Mus musculus avec un inoculum contenant des gamétocytes de deux clones génétiquement distincts qui diffèrent dans les phénotypes d'intérêt et en permettant aux moustiques de se nourrir de souris infectées quatre jours après l'infection. La présence de gamétocytes mâles et femelles dans le sang au microscope de la souris est confirmée avant la tétée. Dans les 48 heures après le repas, dans l'intestin moyen du moustique, les gamétocytes haploïdes se différencier en gamètes mâles et femelles, fertiliser, et forment un zygote diploïde (Fig. 1). Pendant le développement d'un zygote dans un ookinète, méiose semble se produire ^11. Si le zygote est dérivée par la fertilisation croisée entre les gamètes des deux parasites génétiquement distinctes, les échanges génétiques (réassortiment chromosomiques et cross-overs entre les chromatides non-sœurs d'une paire de chromosomes homologues;. Fig 2) peut se produire, résultant en une recombinaison du matériel génétique au locus homologue. Chaque zygote subit deux divisions successives nucléaires, conduisant à quatre noyaux haploïdes. Un ookinète développe davantage dans un oocyste. Une fois l'oocyste mûrit, des milliers de sporozoïtes (la descendance de la croix) sont formés et libérés dans hemoceal moustiques. Les sporozoïtes sont récoltées à partir des glandes salivaires et injecté dans un nouvel hôte murin, où le développement stade pré-érythrocytaire et érythrocytaire a lieu. Formes érythrocytaires sont clonés et classés à l'égard des caractères distinctifs des lignées parentales avant la cartographie de liaison génétique. Contrôle des infections de l'individu clones parentaux sont effectuées de la même manière que la production d'un croisement génétique.

Protocol

Techniques d'asepsie doivent être appliquées à tous les matériaux qui seront administrés dans des animaux pour éviter l'introduction involontaire d'agents infectieux exogènes dans des souris qui peuvent confondre les résultats expérimentaux. 1. L'infection de souris de laboratoire avec des parasites du paludisme au stade sanguin A température ambiante, le dégel deux flacons contenant les parasites du sang congelé stade de la malaria à franchir. Dans ce…

Discussion

Nous démontrer les techniques pour la production d'un croisement génétique chez le rongeur le paludisme à Plasmodium yoelii, qui est également applicable à la production des croisements génétiques dans les paludismes autres rongeurs. Infections des souris avec une seule clones parentaux sont généralement effectués pour déterminer la transmission réussie des parasites des parents pour s'assurer que les parents sont compétents dans la production de gamètes fonctionnels avant d'effectuer…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Glyerolyte 57 solution		Cenmed	4A7833
Mouse Mus musculus		Charles River Laboratory		Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum		Invitrogen	26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution		Invitrogen	10010-072	pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium yoelii yoelii 17XNL(1.1)		MR4	MRA-593	deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium yoelii nigeriensis N67		MR4	MRA-427	deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi		MR4	MRA-128	deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter		Nexcelom Biosciences	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer		Nexcelom Biosciences	Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit		Roche Applied Science	11 796 828 001
Calcium chloride		Sigma-Aldrich	C5670	Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified		Sigma-Aldrich	GS500
Ketamine hydrochloride		Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride		Sigma-Aldrich	P5405	Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride		Sigma-Aldrich	S5886	Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate		Sigma-Aldrich	S4641
Xylazine		Akorn Inc.	4811-20ml	Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool		VWR	32848-003
Glass capillary (1 μL)		VWR	53440-001
Hemocytometer		VWR	15170-168	Complete chamber set
Homogenizer		VWR	KT749520-0090	Pestle with matching tube, 1.5 mL

SUPPLEMENTARY MATERIALS:

• Maintenance of laboratory mice
• Maintenance of laboratory mosquitoes
• Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain
• Measurement of red blood cell density

Maintenance of laboratory mice

Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Maintenance of laboratory mosquitoes

Mosquitoes are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium yoelii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquitoes are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm³ open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging.

Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain

Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 10⁷ infected RBC intraperitoneally or 10⁶ infected RBC intravenously.

Measurement of red blood cell density

Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as “in” if it overlaps the top or right lines and “out” if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the “red blood cell” option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.