Detta protokoll beskriver de steg som krävs för att dissekera, transfektera via elektroporation och kultur mus hippocampus och kortikala neuron. Kortfristiga kulturer kan användas för studier av axon utväxt och vägledning, medan de långa kulturer kan användas för studier av synaptogenesis och dendritiska ryggraden analys.
Hippocampus och kortikala neuron har använts i stor utsträckning för att studera det centrala nervsystemet (CNS) neuronala polarisation, axonet / Dendrite utväxt och synaps bildning och funktion. En fördel med odling av dessa nervceller är att de lätt polarisera och bildar distinkta axoner och dendriter, på en tvådimensionell substrat vid mycket låga tätheter. Denna egenskap har gjort dem mycket användbara för att bestämma många aspekter av nervsystemets utveckling. Dessutom, genom att tillhandahålla gliaceller konditionering för dessa nervceller de kommer att fortsätta att utvecklas och bildar funktionella synapsförbindelser och efterlevande i flera månader i kulturen. I detta protokoll redogör vi för en teknik att dissekera, kultur och transfektera embryonala mus hippocampus och kortikala neuron. Transfektion sker genom electroporating DNA i nervceller innan bordläggningen via nucleofection. Detta protokoll har fördelen att uttrycka fluorescerande-märkta fusionsproteiner tidigt i utvecklingen (~ 4-8hrs efter plating) för att studera dynamiken och funktion av proteiner under polarisering, axon utväxt och förgrening. Vi har också upptäckt att denna enda transfektion innan plätering upprätthåller fluorescerande-märkta uttryck fusionsprotein vid nivåer lämpliga för avbildning hela livstid av neuron (> 2 månader i kultur). Således är denna metod användbar för att studera protein lokalisering och funktion i hela CNS-utveckling med små eller inga störningar i neuronal funktion.
Detta protokoll för odling embryonala hippocampus och hjärnbarken mus nervceller utvecklades som en modifikation av Bankiren-protokollet, som använder råtta neuron 1,2. Vi har använt detta protokoll för odling mus och nervceller hamstern också 3,4,5,6,7. Detta protokoll fungerar lika bra för både hippocampus och hjärnbarkens nervceller och liknar ett protokoll som offentliggjorts av Meberg och Miller 8. Generellt använder vi hippocampus nervceller för långsiktig kultur eftersom de är väl beskriven och ett mer etablerat modellsystem. Dessutom kommer de sannolikt att innehålla en mer homogen population av nervceller än neocortex. Men hjärnbarkens nervceller odlade med hjälp av detta protokoll också överleva och differentiera på samma sätt (opublicerade data). Vi använder rutinmässigt hippocampus och hjärnbarkens nervceller för kortsiktiga kultur. Dissekering av neocortex leder också till betydligt mer neuroner (1.5×10 6 nervceller per par av cortex) än hippocampus dissektion (2.5×10 5 nervceller per par hippocampi), vilket gör det ett bättre val av material för Western blotting, till exempel.
Som med alla primära kultur, är det viktigt att minimera den tid det tar från det att djuret har dött till bordläggning av cellerna. Det görs i regel 10-20 dissektioner att bli konsekvent snabb på dissekering och plätering. Även när du arbetar med Lonza Nucleofector är det viktigt att arbeta snabbt under elektroporation förfarandet, såsom livskraft nervceller minskar snabbt om de är kvar i nucleofection buffert.
Mycket av vårt bildhantering sker med en total inre reflektans fluorescensmikroskopi (TIRFM). Denna typ av mikroskopi kan endast avbildning flera hundra nanometer bortom täckglas. Därför är de områden av nervceller som vi ofta bild, axonal tillväxt konen och ryggar dendritiska, måste följas direkt på täckglas. Därför använder vi låg densitet kulturer som kräver gliaceller utfodring för långsiktig kultur. Vi har använt högre densitet kulturer (> 2×10 4 celler / cm 2), utan gliaceller feeder lager, för långsiktig kulturer och fann att de överlever mycket bra med lite utfodring. Men Dendritutskotten av dessa nervceller är ofta nog för långt bort från underlaget till bilden i TIRFM, även om de lätt kan upptäckas med brett fält mikroskopi eller konfokalmikroskopi.
I de flesta av våra studier har vi transfektera nervceller innan plätering, och har avbildat fluorescerande-märkta proteiner upp till tre månader i kulturen. Denna långsiktiga uttryck av fluorescerande-märkta proteiner ger oss förtroende att genom att använda låga koncentrationer av DNA (1-2μg) att vi inte producerar överuttryck artefakter i nervceller. Däremot kan detta förfarande också användas för att studera överuttryck av protein om stora mängder av DNA som används (10-20μg). Den plasmider som vi använder för att transfektera nervceller innehåller vanligtvis EGFP eller mCherry fusionsproteiner, även om vi också märka neuronala cytoplasman med DsRed2 eller EGFP ensam. Detta elektroporation tekniken fungerar bra med ett antal vektorer. Vi föredrar plasmider som innehåller en β-aktin promotor med CMV förstärkare och β-globin poly-A svans (pCAGGs eller PCAX plasmider) 9, på grund av den relativt höga nivåer av uttryck, och det faktum att de är väl tolereras av nervceller på både kort och lång sikt kultur. Generellt proteiner börjar uttrycka inom ca 4 timmar bordläggningen och nådde tillräcklig för bildbehandling inom 10-24 timmar 10. Vi har framgångsrikt använt CMV-promotor-driven plasmider i kortfristiga kulturer, men har funnit att de kan orsaka höga nivåer av överuttryck som dödar nervceller i långsiktig kultur. Vi har dock funnit att gliaceller konditionering av låg densitet kulturer bidrar med överlevnaden av nervceller transfererats med CMV-promotorn driven plasmider, jämfört med högre densitet (icke-gliaceller matade) kulturer.
The authors have nothing to disclose.
Alla förfaranden godkändes av University of Wisconsin kommittén för djurs vård och var i enlighet med NIH riktlinjer. Vi tackar Dr Katherine Kalil för den generösa användningen av hennes Nucleofector enhet. Vi tackar också medlemmarna i Dent labbet för synpunkter på protokollet. Detta arbete har finansierats med bidrag NIH R01-NS064014, Dana Foundation och Whitehall Foundation för att EWD
Christopher Viesselmann, Jason Ballweg och Derek Lumbard bidragit lika för detta dokument.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Sodium Borate | Fisher | S93356 | Store borate buffer at room temperature (RT). | |
Poly-d-Lysine | Sigma | P7886-100mg | Dissolve in 0.1M borate buffer. Sterile filter and store aliquots at -80°C. | |
Trypsin (10x) | Invitrogen | 15090-046 | Store aliquots at -80°C. | |
DNase (10x) | Sigma | DN25-1G | Store aliquots at -80°C. | |
MEM | Invitrogen | 11095-080 | Store at 4°C. | |
HBSS (10x) | Invitrogen | 14185-052 | Store at RT. | |
HEPES (100x) | Invitrogen | 15630-080 | Store at 4°C. | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Invitrogen | 15140-122 | Store aliquots at -80°C. | |
Horse Serum | Hyclone | SH3007403 | Store aliquots at -80°C. | |
Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25200-056 | Store at 4°C. | |
Neurobasal E (NB) | Invitrogen | 21103-049 | Store at 4°C. | |
B27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | Store aliquots at -80°C. | |
Glutamine (100x) | Invitrogen | 25030-081 | Store aliquots at -80°C | |
30% Glucose in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP350-500 | Dissolve glucose in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
3.75M NaCl in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP358-1 | Dissolve NaCl in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH3007003 | Store aliquots at -80°C. | |
Paraffin/Petroleum Jelly (3:1 w/w) | Fisher | Paraffin – P31-500 Petroleum – P66-1 | Combine in conical tube and melt in boiling water. | |
Concentrated Nitric Acid (HNO3) | Fisher | A509-212 | Store at room temperature. Can be reused several times. Discard if it yellows. | |
5mM cytosine –B-D-arabinofuranoside hydrochoride (AraC) in NB (1000X) | Sigma | C6645 | Dissolve AraC in NB and sterile filter. Store at -80°C |
*Most reagents that we store at -80°C can be stored at -20°C as well. Storing them at -80°C lengthens their shelf life and results in slightly more consistent cultures.