Herstellung von Hühnerembryo-Extrakt für die Kultivierung von Murine Neural Crest Stem Cells
Summary
Um Neuralleiste Stammzellen (NCSC) in vitro zu kultivieren, ist ein spezielles Medium (NCSCM) erforderlich. Wesentlicher Bestandteil der NCSCM ist Hühnerembryo-Extrakt (CEE). Wir beschreiben hier genaue Techniken, um eine maximale Menge an reinem und hochwertigem CEE, einschließlich Details wie die Isolierung, Mazeration, Zentrifugation und Filtration zu produzieren.
Abstract
Die Neuralleiste ergibt sich aus der Neuro-Ektoderm während der Embryogenese und besteht nur vorübergehend. Frühe Experimente bereits geprüften pluripotenten Vorläuferzellen zu einem integralen Bestandteil der Neuralleiste 1 sein. Phänotypisch sind Neuralleiste Stammzellen (NCSC) durch die simultane Expression p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) und SOX10 während ihrer Wanderung von der Neuralleiste 2,3,4,5 definiert. Diese Vorläuferzellen können in glatten Muskelzellen, chromaffinen Zellen, Neuronen und Gliazellen, sowie Melanozyten, Knorpel und Knochen 6,7,8,9 unterscheiden. Zu kultivieren NCSC in vitro, eine besondere Neuralleiste Stammzellen Medium (NCSCM) ist 10 erforderlich. Der komplexeste Teil des NCSCM ist die Herstellung von Hühnerembryo-Extrakt (CEE) vertreten eine wesentliche Quelle von Wachstumsfaktoren für die NCSC sowie für andere Arten von neuronalen Explantaten. Andere NCSCM Zutaten neben CEE sind im Handel erhältlich. Producing CCE mit Labor-Grundausstattung ist es von großer Bedeutung, um über die schwierigen Details wie die Isolierung, Mazeration, Zentrifugation und Filtration Prozesse kennen. In diesem Protokoll beschreiben wir genauer Techniken, um eine maximale Menge an reinem und hochwertigem CEE produzieren.
Protocol
Discussion
Dieses Protokoll basiert auf Modifikationen der Verfahren, die in den letzten 10,11 beschrieben worden sind, basiert. Zusätzlich zu früheren Veröffentlichungen haben wir hier zeigen die einzelnen unterschiedlichen Schritte des Prozesses mehr ausgeweitet. Dies unterstützt den Experimentator mit den wichtigsten Daten sichern richtige Verfahren und zuverlässige Ergebnisse. Ferner ist, wie die Zerlegung Prozess ist ein wesentlicher Bestandteil der CEE-Extraktion beschreiben wir das Verfahren der Aufnahme der…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Unterstützung und Beratung von Markus Pajtler und Robert Bohrer waren von unschätzbarem Wert für die Visualisierung dieses Protokolls.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 11 days incubated chicken eggs | Sörries-Trockels Vermehrungszucht GmbH & Co.KG | |||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke & Mayr GmbH | |||
| DMEMGlutamax | GIBCO Invitrogen | |||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | |||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One GmbH | |||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | |||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | |||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific AG | |||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One GmbH | |||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
