Produzione di estratto di Chick dell'embrione per la coltivazione delle cellule della cresta neurale Murine staminali
Summary
Per coltivare le cellule staminali neurali cresta (NCSC) in vitro, un mezzo speciale (NCSCM) è obbligatorio. Parte essenziale della NCSCM è embrione estratto di pulcino (CEE). Noi qui descrivere le tecniche accurate per produrre una quantità di massimizzare la qualità CEE pura e alta, compresi i dettagli come l'isolamento, la macerazione, centrifugazione, filtrazione e processi.
Abstract
La cresta neurale nasce dalla neuro-ectoderma durante l'embriogenesi e persiste solo temporaneamente. Primi esperimenti già prova di cellule progenitrici pluripotenti di essere parte integrante della cresta neurale 1. Fenotipicamente, le cellule staminali neurali cresta (NCSC) sono definite dal simultaneamente esprimendo p75 (affine a basso fattore di crescita dei recettori nervosi, LNGFR) e SOX10 durante la loro migrazione dalla cresta neurale 2,3,4,5. Queste cellule staminali possono differenziarsi in cellule muscolari lisce, cellule cromaffini, neuroni e cellule gliali, così come melanociti, cartilagine e osso 6,7,8,9. Per coltivare NCSC in vitro, uno speciale medium cresta neurale delle cellule staminali (NCSCM) è richiesto 10. La parte più complessa del NCSCM è la preparazione di estratto pulcino dell'embrione (CEE) che rappresenta una fonte essenziale di fattori di crescita per il NCSC così come per altri tipi di espianti neurale. Altri ingredienti NCSCM accanto CEE sono disponibili in commercio. Produrre CCE uso di apparecchiature di laboratorio standard è di grande importanza per conoscere i dettagli impegnativo come l'isolamento, la macerazione, centrifugazione, filtrazione e processi. In questo protocollo si descrivono le tecniche accurate per produrre una quantità di massimizzare la qualità CEE pura e alta.
Protocol
Discussion
Questo protocollo si basa su modificazioni delle procedure che sono state descritte in passato 10,11. Oltre alle pubblicazioni precedenti abbiamo qui mostrare le singole fasi diverse del processo più esteso. Questo sostiene lo sperimentatore con dettagli importanti garantendo procedimenti corretti e risultati affidabili. Inoltre, come il processo di dissezione è una parte essenziale di estrazione CEE descriviamo la procedura di presa degli embrioni fuori dal sacco vitellino in ogni dettaglio. Ci sono divers…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il supporto e la consulenza di Markus Pajtler e Robert Bohrer sono stati preziosi per la visualizzazione di questo protocollo.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 11 days incubated chicken eggs | Sörries-Trockels Vermehrungszucht GmbH & Co.KG | |||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke & Mayr GmbH | |||
| DMEMGlutamax | GIBCO Invitrogen | |||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | |||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One GmbH | |||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | |||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | |||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific AG | |||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One GmbH | |||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
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