Produktion av Chick Embryo Extract för odling av murina neurala celler Crest Stem
Summary
Att odla neurala celler crest stamceller (NCSC) in vitro, är ett speciellt medium (NCSCM) krävs. Viktig del av NCSCM är kycklingembryo extrakt (CEE). Vi beskriver här exakta tekniker för att producera en maximal mängd av ren och hög kvalitet CEE, däribland detaljer isolering, maceration, centrifugering och filtrering.
Abstract
Den neurallist beror på neuro-ektoderm under fosterutvecklingen och kvarstår bara tillfälligt. Tidiga experiment säkras redan pluripotenta stamceller som en integrerad del av neural crest 1. Fenotypiskt är neurallist stamceller (NCSC) definieras genom att samtidigt uttrycka p75 (låg-affina nervtillväxtfaktor receptorn, LNGFR) och SOX10 under sin migration från neural crest 2,3,4,5. Dessa stamceller kan differentiera till glatta muskelceller, chromaffin celler, nervceller och gliaceller, liksom melanocyter, brosk och ben 6,7,8,9. Att odla NCSC in vitro, en speciell neural crest stamceller medium (NCSCM) krävs 10. Den mest komplexa delen av NCSCM är beredningen av kycklingembryo extrakt (CEE) som representerar en viktig källa till tillväxt faktorer för NCSC liksom för andra typer av neurala explants. Andra NCSCM ingredienser bredvid CEE finns kommersiellt tillgängliga. Producera CCE använda laboratorieutrustning standardutrustning är det av stor vikt att veta om de utmanande uppgifter som isolering, maceration, centrifugering och filtrering. I detta protokoll beskriver vi exakt tekniker för att producera en maximal mängd av ren och hög kvalitet CEE.
Protocol
Discussion
Detta protokoll är baserad på modifieringar av förfaranden som har beskrivits tidigare 10,11. Förutom tidigare publikationer visar vi här den enskilde olika stegen i processen utvidgats. Detta stöder försöksledaren med viktiga detaljer säkerställa korrekta förfarandet och pålitliga resultat. Vidare, eftersom dissektion processen är en viktig del av CEE utvinning vi beskriver förfarandet för att ta embryon ur gulan säck i varje detalj. Det finns flera viktiga punkter att notera som diskuteras n…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stöd och råd av Markus Pajtler och Robert Bohrer var ovärderliga för visualisering av detta protokoll.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 11 days incubated chicken eggs | Sörries-Trockels Vermehrungszucht GmbH & Co.KG | |||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke & Mayr GmbH | |||
| DMEMGlutamax | GIBCO Invitrogen | |||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | |||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One GmbH | |||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | |||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | |||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific AG | |||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One GmbH | |||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
