Pour cultiver des cellules souches neurales de crête (NCSC) in vitro, un milieu spécial (NCSCM) est nécessaire. Partie essentielle de NCSCM est extrait d'embryon de poulet (PECO). Nous décrivons ici les techniques précises pour produire une quantité maximisée de qualité pure et de haute PECO, y compris des détails comme l'isolement, la macération, la centrifugation et la filtration.
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Article de méthode
Production d'extrait d'embryon de poulet pour la culture des neurones murins Cellules souches Crest
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La crête neurale provient de la neuro-ectoderme cours de l'embryogenèse et persiste seulement temporairement. Les premières expériences déjà épreuve cellules progénitrices pluripotentes à être une partie intégrante de la crête neurale 1. Phénotypiquement, les cellules souches neurales de crête (NCSC) sont définis par exprimant simultanément p75 (bas-affine récepteur du facteur de croissance nerveuse, LNGFR) et SOX10 pendant leur migration de la crête neurale 2,3,4,5. Ces cellules progénitrices peuvent se différencier en cellules musculaires lisses, cellules chromaffines, neurones et cellules gliales, ainsi que les mélanocytes, les cartilages et les os 6,7,8,9. Pour cultiver NCSC in vitro, une moyenne spéciale cellules de la crête neurale tige (NCSCM) est requise 10. La partie la plus complexe de la NCSCM est la préparation d'extrait d'embryon de poulet (PECO) qui représente une source essentielle de facteurs de croissance pour le NCSC ainsi que pour d'autres types d'explants de neurones. Autres ingrédients NCSCM côté PECO sont disponibles commercialement. Produire du CCE de laboratoire utilisant un équipement standard, il est de grande importance pour connaître les détails difficiles que l'isolement, la macération, la centrifugation et la filtration. Dans ce protocole, nous décrivons des techniques précises pour produire une quantité maximisée de qualité pure et de haute PECO.
Protocole
Les auteurs indiquent que les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les Communautés européennes la directive du Conseil (86/609/CEE), suivant les directives du NIH concernant les soins et l'utilisation d'animaux pour des procédures expérimentales et les règlements énoncés par le comité institutionnel soin et l'utilisation comité (IACUC) à l'Université de Duisburg-Essen (Allemagne).
Partie 1: Configuration (non montré sur la vidéo)
PRÉPARATION DES MATÉRIAUX ET SOLUTIONS (avant de prendre les oeufs de l'incubateur)
- Les œufs ont à incuber dans un incubate....
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Discussion
Ce protocole est basé sur les modifications de procédures qui ont été décrites dans le passé, 10,11. En plus des publications anciennes, nous montrent ici les différentes étapes différentes du processus plus étendu. Cela soutient l'expérimentateur avec des détails importants assurant une procédure correcte et des résultats fiables. En outre, comme le processus de dissection est une partie essentielle de l'extraction de l'ECO, nous décrivons la procédure de prise des embryons hors du sac jaune dans.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Le soutien et les conseils de Markus et Robert Pajtler Bohrer ont été inestimables pour la visualisation de ce protocole.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Œufs de poule incubés pendant 11 jours | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Spray désinfectant alcoolique | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Seringue stérile (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubes stériles (50 ; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Pointes de pipette stériles | Starlab GmbH | ||
| Hyaluronidase de type IV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Stericups Milipore stériles (0,45 ; 0,22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipettes stériles (25 ; 10 ; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrifugeuse L5-50 | Type de rotor Ti-45 |
Références
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 7....
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Réimpressions et autorisations
