Assaying Oberfläche Expression von Chemosensoren in heterologen Zellen
Summary
Hier zeigen wir ein Protokoll für die Durchführung Lebendzellfärbungen, die zur Geruchsrezeptoren auf der Oberfläche von Zellen HEK293T bequem nachgewiesen werden können. Darüber hinaus kann es auch zum Testen auf Oberflächenexpression von anderen Chemosensoren oder GPCRs verwendet werden.
Abstract
Die lebendige Welt der Gerüche ist durch den Sinn des Geruchssinns anerkannt. Der Geruchssinn Mäusen wird durch ein Repertoire von etwa 1200 G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) 1, die postuliert, dass flüchtige Duftmoleküle binden und Umwandlung der extrazellulären Signals in ein intrazelluläres Signal durch Kopplung mit G-Protein Gαolf vermittelt. Die Bindung des Geruchsstoffen an die Rezeptoren wird angenommen, dass eine kombinatorische Regel, dass man Geruchsstoff kann mehrere Rezeptoren binden und einen Rezeptor können verschiedene Geruchsstoffe in unterschiedlichem Maße 2 zu binden folgen. Biochemische, Signal-und Ligandenbindung Studien wurden bequemerweise für die meisten GPCRs unter Verwendung heterologen Zellen. Doch der heterologen Zellen verwenden für das Studium der Geruchsrezeptoren war für eine lange Zeit ausgeschlossen, da auf die Transfektionseffizienz sie an die Oberfläche zu exportieren ist fehlgeschlagen. Saito et al haben Einzel-Membran passieren Rezeptor Transport Protein (RTP) Familie Chaperone zeigen erhöhte Expression in den Riechzellen und fungieren als Chaperone für den Verkehr Geruchsrezeptoren auf der Oberfläche in heterologen Zellen, wenn co zusammen transfiziert 3 gezeigt. Zur Durchführung biochemischer Assays für Rezeptoren mit heterologen Zellen, muss man zunächst ermitteln, ob der Rezeptor zeigt robuste Oberfläche Ausdruck in der Zell-Linie. Dies kann durch die Überexpression der Rezeptoren mit dem Chaperon RTP1S durch Lebendzellfärbungen zu Fluoreszenz-Label der extrazellulären Domäne oder einen Tag in der extrazellulären Domäne ausschließlich gefolgt getestet werden. Hier zeigen wir ein Protokoll für die Durchführung Lebendzellfärbungen, die zur Geruchsrezeptoren auf der Oberfläche von Zellen HEK293T bequem nachgewiesen werden können. Darüber hinaus kann es auch zum Testen auf Oberflächenexpression von anderen Chemosensoren oder GPCRs verwendet werden.
Protocol
Discussion
Jeder Schritt muss sorgfältig mit einem auffälligen und markanten Oberflächenbeschmutzung sicher durchgeführt werden. Die gesamte Färbung muss in kaltem durchgeführt werden (auf Eis), und das Tablett, auf dem Deckgläschen gelegt werden muss vor gekühlt werden, um zu verwenden, um sicherzustellen, Zellen am Leben bleiben. Außerdem Fixierung am Ende der Oberfläche Färbung durchgeführt. Dies steht in krassem Gegensatz zu internen Färbung, wo Fixierung Färbung an der Zellmembran zu primären und sekundären An…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Matsunami Labor für die kritische Durchsicht des Manuskripts.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Scientific | 72200-11 | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000 | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | ||
| Minimal essential medium | Sigma | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | ||
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | Gibco | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium | |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma | P7280 | ||
| Sodium Azide | EM Science | SX0299-1 | ||
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon | 353801 | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
