Labeling F-actine Prikkeldraad Eindigt op Rhodamine-actine in gepermeabiliseerde neuronale groei Cones
Summary
Een methode om te visualiseren en te kwantificeren F-actine weerhaken eindigt in neuronale groei kegels wordt beschreven. Na het kweken neuronen op glas dekglaasjes worden cellen gepermeabiliseerd met een saponine-bevattende oplossing. Dan, een korte incubatie met de saponine buffer met rhodamine-actine bevat fluorescerende actine op gratis actine prikkeldraad eindigt.
Abstract
De beweeglijke uiteinden van de groeiende axonen worden genoemd groei kegels. Groei kegels leiden navigeren axonen door het ontwikkelen van weefsels door interactie met lokaal uitgedrukt moleculaire begeleiding signalen dat de groei kegel-receptoren binden en reguleren van de dynamiek en de organisatie van de groei kegel cytoskelet 3-6. Het voornaamste doel van deze navigatie-signalen is het actine filament meshwork dat de groei kegel periferie en dat drijft de groei conus beweeglijkheid door middel van voortdurende actine polymerisatie en dynamische remodeling 7 vult. Positief of aantrekkelijk begeleiding signalen veroorzaken de groei kegel te draaien door het stimuleren van actine filament (F-actine) polymerisatie in de regio van de groei kegel periferie, dat is dichter bij de bron van de lokstof cue. Deze actine polymerisatie drijft lokale groeikegel uitsteken, hechting van de toonaangevende marge en axonale rek in de richting van de lokstof.
Actinefilamenten polymerisatie is afhankelijk van de beschikbaarheid van voldoende actine monomeer en op de polymerisatie kernen of actine filament prikkeldraad eindigt voor de toevoeging van monomeer. Actine monomeer is overvloedig aanwezig in de kuiken het netvlies en de dorsale wortel ganglion (DRG) groei kegels. Bijgevolg, polymerisatie neemt snel toe als free F-actine prikkeldraad eindigt beschikbaar komen voor monomeer toevoeging. Dit gebeurt in het kuiken DRG en retinale groei kegels via de lokale activering van de F-actine verbreken eiwit actine depolymerizing factor (ADF / cofilin) in de groeikegel regio dichter bij een attractant 8-10. Deze verhoogde ADF / cofilin activiteit Severs actine filamenten het creëren van nieuwe F-actine weerhaken uiteinden voor polymerisatie. De volgende methode demonstreert dit mechanisme. Totale gehalte aan F-actine wordt gevisualiseerd door kleuring met fluorescerende phalloidin. F-actine weerhaken uiteinden zijn gevisualiseerd door de incorporatie van rhodamine-actine in groei kegels die gepermeabiliseerd met de procedure beschreven in het volgende, dat is een bewerking van eerdere studies van andere beweeglijke cellen 11, 12. Wanneer rhodamine-actine wordt toegevoegd bij een concentratie boven de kritische concentratie voor actine monomeer naast prikkeldraad eindigt, rhodamine-actine monteert op gratis prikkeldraad eindigt. Als de aantrekkelijke cue wordt gepresenteerd in een verloop, zoals het vrijkomen van een micropipet geplaatst aan een kant van een groei kegel, zal de integratie van rhodamine-actine op F-actine prikkeldraad eindigt groter zijn in de groei kegel kant in de richting van de micropipet 10 .
De groei kegels zijn klein en delicaat celstructuren. De procedures van permeabilisatie, rhodamine-actine oprichting, fixatie en fluorescentie visualisatie zijn allemaal zorgvuldig gebeuren en kan worden uitgevoerd op het podium van een omgekeerde microscoop. Deze methoden kunnen worden toegepast op het bestuderen van de lokale actine polymerisatie bij het migreren van neuronen, andere primaire weefsels cellen of cellijnen.
Protocol
Discussion
De methoden die hier staat temporele en ruimtelijke resolutie van cellulaire componenten die in de dynamische verbouwing van het actine cytoskelet betrokken bij de toonaangevende marge van het migreren van de groei kegels. De actie van de lokstof moleculen, zoals NGF of netrine, om snel te stimuleren actine filament polymerisatie wordt onthuld als een lokale toename van de actine prikkeldraad eindigt, gecreëerd door actine filament verbreken door de activering van ADF / cofilin 10, zoals getoond in de figure…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken dr. James Bamburg en leden van zijn laboratorium voor samenwerking in deze studies. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie HD19950, EY07133 en door subsidies van de Minnesota Medical Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 18×18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | ||
| 35mm Petri dishes | Falcon | 351008 | ||
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | ||
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma | P1024 | ||
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | ||
| L1 CAM | R & D systems | 777-NC | ||
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen (Molecular Probes) | A22281 | ||
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | ||
| F12 Culture medium | Invitrogen (Gibco) | 21700-075 | ||
| B27 | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | ||
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Letourneau, P., Squire, L. R. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. Encyclopedia of Neuroscience. , 1139-1145 (2008).
- Kalil, K., Dent, E. W. Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton. Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40, 209-227 (2003).
- Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. Actin-binding proteins take the reins in growth cones. Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).
- Guan, K. L., Rao, Y. Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).
- Gallo, G., Letourneau, P. C. Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues. J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).
- Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin. Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).
- Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. ADF/cofilin: A functional node in cell biology. Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).
- Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1. Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).
- Symons, M. H., Mitchison, T. J. Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts. J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).
- Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells. J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).
