透過処理神経成長円錐におけるローダミン-アクチンとF -アクチンばら両端にラベルを付ける
Summary
神経成長円錐におけるF -アクチン有刺鉄線両端を視覚化し、定量化する方法が記載されている。ガラス製カバースリップ上で培養ニューロン後、細胞をサポニン含有溶液に透過処理されています。その後、ローダミン-アクチンを含むサポニンバッファと短いインキュベーションは無料アクチン有刺鉄線端上に蛍光アクチンを内蔵しています。
Abstract
成長する軸索の運動性のヒントは、成長円錐と呼ばれています。成長円錐は、成長円錐の受容体に結合し、ダイナミクスと成長円錐細胞骨格3-6の組織を制御するローカルで表される分子指導の手がかりとの相互作用によって開発組織を通じて軸索をナビゲートつながる。これらのナビゲーション信号の主な目標は、継続的なアクチンの重合と動的な改造7まで成長円錐の外周部とそのドライブの成長円錐の運動性を満たすアクチンフィラメントの網細工です。正または魅力的な指導の手がかりは、刺激アクチンフィラメント（F -アクチン）誘引キューのソース近いです成長円錐の周辺の地域における重合によって回転成長円錐を誘発する。このアクチンの重合は、主要なマージンと誘引に向かって軸索伸長のローカル成長円錐の突起、付着を駆動します。
アクチンフィラメントの重合は、十分なアクチンの単量体の可用性にし、モノマーの添加のための重合核やアクチンフィラメント有刺鉄線端に依存します。アクチン単量体はニワトリ網膜および後根神経節（DRG）成長円錐における豊富に入手可能です。無料のF -アクチン有刺鉄線両端がモノマーの添加のために利用可能になった場合、その結果、重合が急速に増大する。これはひよこDRGと誘引80から10に近い成長円錐の領域でのF -アクチン切断するタンパク質のアクチン脱重合因子（ADF /コフィリン）の局所活性化を介して網膜成長円錐で発生します。この強化されたADF /コフィリンの活性は、重合のための新しいF -アクチン有刺鉄線両端を作成するためにアクチンフィラメントを切断。次のメソッドは、このメカニズムを示しています。 F -アクチンの合計含有量は、蛍光ファロイジンで染色して可視化される。 F -アクチンとげがある両端が他の運動性の細胞が11、12の以前の研究から適応され、以下で説明する手順で透過処理される成長円錐内にローダミン-アクチンの取り込みにより可視化。ローダミン-アクチンはとげがある両端にアクチン単量体の付加のための臨界濃度以上の濃度で添加されている場合、ローダミン-アクチンは、無料のタケノコの端の上に組み立てます。魅力的な合図がそのような成長円錐の片側に位置し、マイクロピペットから放出されるものとして、勾配で提示されている場合は、F -アクチン上にローダミン-アクチンの取り込みは、とげの端は、マイクロピペット10に向けて成長円錐の側に大きくなる。
成長円錐は、小さくて繊細なセル構造です。透過、ローダミン-アクチン取り込み、固定および蛍光可視化の手順はすべて慎重に行われており、倒立顕微鏡のステージ上で行うことができる。これらのメソッドは、移行するニューロン、他の主要な組織の細胞または細胞株におけるローカルアクチンの重合を研究に適用することができます。
Protocol
Discussion
メソッドは、成長円錐の移行の主要なマージンにおけるアクチン細胞骨格の動的変化に関与する細胞成分の時間的および空間分解能を可能にするここで紹介。急速にアクチンフィラメントの重合を促進するNGFまたはネトリンのような誘引分子の作用は、図1及び図2に示すように活性化されたADF /コフィリン10でアクチンフィラメント切断によって作成されたアクチンとげが終了、、で?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、博士はジェームズBamburgとこれらの研究におけるコラボレーションのための彼の研究室のメンバーに感謝。この作品は、NIHの助成金HD19950、EY07133で、ミネソタ医学財団からの補助金によって賄われていた。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 18×18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | ||
| 35mm Petri dishes | Falcon | 351008 | ||
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | ||
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma | P1024 | ||
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | ||
| L1 CAM | R & D systems | 777-NC | ||
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen (Molecular Probes) | A22281 | ||
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | ||
| F12 Culture medium | Invitrogen (Gibco) | 21700-075 | ||
| B27 | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | ||
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Letourneau, P., Squire, L. R. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. Encyclopedia of Neuroscience. , 1139-1145 (2008).
- Kalil, K., Dent, E. W. Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton. Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40, 209-227 (2003).
- Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. Actin-binding proteins take the reins in growth cones. Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).
- Guan, K. L., Rao, Y. Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).
- Gallo, G., Letourneau, P. C. Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues. J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).
- Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin. Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).
- Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. ADF/cofilin: A functional node in cell biology. Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).
- Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1. Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).
- Symons, M. H., Mitchison, T. J. Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts. J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).
- Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells. J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).
