Nöronal Büyüme Konileri permeabilize rodamin-aktin ile F-aktin Dikenli Ends Etiketleme
Summary
Nöronal büyüme konileri dikenli biter görselleştirmek ve F-aktin ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Cam lamelleri kültür nöronlar sonra, hücreler saponin içeren bir çözüm permeabilize. Sonra, rodamin-aktin içeren saponin tamponu ile kısa bir inkübasyon ücretsiz aktin dikenli uçları üzerine floresan aktin içermektedir.
Abstract
Büyüyen aksonlar hareketli ipuçları büyüme konileri denir. Büyüme konileri, gelişmekte olan dokularda büyüme konisi reseptörlerine bağlanır ve yerel dinamikleri ve büyüme koni hücre iskeletinin 3-6 organizasyonu düzenleyen ifade edilen moleküler rehberlik ipuçları ile etkileşim yoluyla aksonlar seyreden yol açmaktadır. Bu seyir sinyallerinin ana hedefi, büyüme konisi çevre ve aktin polimerizasyonu sürekli ve dinamik bir yeniden şekillenme 7 ile bu sürücüleri büyüme konisinin motilite doldurur aktin filament ağda . Pozitif ya da çekici rehberlik ipuçları uyarıcı aktin filament (F-aktin) cezbedici işaret kaynağı yakın büyüme konisi çevre bölgede polimerizasyonu dönüm büyüme konisi neden olur. Bu aktin polimerizasyonu sürücüler, önde gelen marjı ve cezbedici doğru aksonal uzama yerel büyüme konisi çıkıntı, yapışma.
Aktin filament polimerizasyon yeterli aktin monomer durumu ve ek monomer polimerizasyonu çekirdekleri veya aktin filament dikenli biter bağlıdır. Aktin monomeri civciv retina ve dorsal kök gangliyon (DRG) büyüme konileri bol miktarda mevcuttur. Sonuç olarak, F-aktin dikenli biter monomer eklenmesi için kullanılabilir hale polimerleşme hızla artmaktadır. Bu daha yakın bir cezbedici 8-10 büyüme koni bölgede faktörü (ADF / cofilin) depolymerizing F-aktin kesilmesinin protein aktin yerel aktivasyon ile civciv DRG ve retinal büyüme konileri oluşur . Bu artan ADF / cofilin aktivite, yeni F-aktin polimerizasyonu için dikenli biter oluşturmak için aktin filamentler koparır. Aşağıdaki yöntem bu mekanizma ortaya koymaktadır. F-aktin Toplam içerik floresan Phalloidin ile boyanarak görünür hale getirilir. F-aktin dikenli uçları diğer hareketli hücreler 11, 12, önceki çalışmalarda adapte aşağıdaki açıklanan prosedüre permeabilize büyüme konileri içinde rodamin-aktin kuruluş tarafından görüntülenmiştir. Rodamin-aktin, aktin monomeri dikenli biter eklenmesi için kritik konsantrasyon üstünde bir konsantrasyon eklendiğinde, rodamin-aktin ücretsiz dikenli uçları üzerine toplanır. Çekici ipucu gibi bir büyüme konisinin bir tarafa yerleştirilmiş bir mikropipet serbest bırakılması gibi bir degrade, sunulan ise, F-aktin dikenli uçları üzerine rodamin-aktin katılması doğru mikropipet 10 büyüme konisinin tarafında daha fazla olacaktır .
Büyüme konileri küçük ve narin hücre yapıları. Permeabilization, rodamin aktin dahil, fiksasyon ve floresan görselleştirme işlemleri titizlikle yapılmaktadır ve ters bir mikroskop sahnede yapılabilir. Bu göç eden nöronlar, diğer birincil doku hücrelerinin veya hücre hatları yerel aktin polimerizasyonu eğitim yöntemleri uygulanabilir.
Protocol
Discussion
Yöntemleri, büyüme konileri geçiş önde gelen marjı aktin hücre iskeletinin dinamik remodeling katılan hücresel bileşenlerinin zamansal ve mekansal çözünürlükte izin sundu. NGF veya Netrin gibi cezbedici molekülleri, hızla aktin filament polimerizasyonu teşvik etmek için Şekil 1 ve 2'de gösterildiği gibi aktin dikenli biter aktif ADF / cofilin 10 aktin filament kesilmesinin tarafından oluşturulan yerel bir artış, eylem olarak ortaya çıkıyor. Bu yöntem radixin, Şekil 3 ve 4 r…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr James Bamburg ve bu çalışmalarda işbirliği için onun laboratuvar üyelerine teşekkür ediyorum. Bu çalışma NIH hibe HD19950, EY07133 ve Minnesota Tıp Vakfı'nın bağışları ile finanse edilmiştir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 18×18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | ||
| 35mm Petri dishes | Falcon | 351008 | ||
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | ||
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma | P1024 | ||
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | ||
| L1 CAM | R & D systems | 777-NC | ||
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen (Molecular Probes) | A22281 | ||
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | ||
| F12 Culture medium | Invitrogen (Gibco) | 21700-075 | ||
| B27 | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | ||
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Letourneau, P., Squire, L. R. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. Encyclopedia of Neuroscience. , 1139-1145 (2008).
- Kalil, K., Dent, E. W. Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton. Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40, 209-227 (2003).
- Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. Actin-binding proteins take the reins in growth cones. Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).
- Guan, K. L., Rao, Y. Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).
- Gallo, G., Letourneau, P. C. Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues. J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).
- Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin. Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).
- Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. ADF/cofilin: A functional node in cell biology. Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).
- Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1. Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).
- Symons, M. H., Mitchison, T. J. Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts. J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).
- Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells. J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).
