Une méthode de visualiser et de quantifier la F-actine se termine barbelés dans les cônes de croissance neuronale est décrite. Après les neurones en culture sur des lamelles en verre, les cellules sont perméabilisées avec une solution contenant de la saponine. Ensuite, une courte incubation avec le tampon de la saponine contenant rhodamine-actine intègre actine fluorescente sur l'actine se termine sans barbelés.
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Article de méthode
Etiquetage F-actine se termine avec des barbelés rhodamine-actine dans les cônes de croissance neuronale perméabilisées
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les conseils mobiles des axones en croissance sont appelées cônes de croissance. Cônes de croissance conduisent naviguer axones à travers les tissus en développement en interaction avec les signaux de guidage exprimés au niveau local moléculaires qui lient les récepteurs du cône de croissance et de réguler la dynamique et l'organisation du cytosquelette de la croissance cône 3-6. La cible principale de ces signaux de navigation est le maillage filament d'actine qui remplit la périphérie du cône de croissance et que la motilité du cône de croissance grâce à des lecteurs polymérisation de l'actine et le remodelage continu dynamiques 7. Signaux de guidage positif ou attrayante induisent cône de croissance tourne en stimulant filaments d'actine (actine F) de polymérisation dans la région de la périphérie du cône de croissance qui est près de la source de la queue attractif. Cette polymérisation de l'actine disques locaux cône de protrusion de croissance, l'adhérence de la marge de leader et l'allongement des axones vers l'attractif.
Filaments d'actine de polymérisation dépend de la disponibilité du monomère d'actine suffisante et sur les noyaux de polymérisation ou se termine filament d'actine barbelés pour l'addition de monomère. L'actine monomère est disponible en abondance dans le ganglion de la racine dorsale de la rétine et poussins (GHM) des cônes de croissance. En conséquence, la polymérisation augmente rapidement quand il est libre F-actine se termine barbelés deviennent disponibles pour l'addition de monomère. Cela se produit dans chiches DRG et les cônes de croissance rétiniens via l'activation locale de l'actine F-actine rupture protéines dépolymérisation facteur (ADF / cofiline) dans la région du cône de croissance plus proche d'un 80-10 attractif. Ce accrue ADF / cofiline activité Severs filaments d'actine à créer de nouveaux F-actine se termine barbelés pour la polymérisation. La méthode suivante illustre ce mécanisme. Contenu total de la F-actine est visualisée par coloration avec la phalloïdine fluorescente. F-actine se termine barbelés sont visualisés par l'incorporation de la rhodamine-actine dans les cônes de croissance qui sont perméabilisées avec la procédure décrite dans la suivante, qui est adapté à partir des études antérieures sur d'autres cellules mobiles 11, 12. Lorsque la rhodamine-actine est ajouté à une concentration supérieure à la concentration critique pour l'addition de monomères d'actine à l'extrémité de fer barbelé, la rhodamine-actine assemble sur des extrémités libres de fer barbelé. Si le repère attractif est présenté dans un dégradé, comme d'être libéré d'une micropipette positionné sur un côté d'un cône de croissance, l'incorporation de la rhodamine-actine sur F-actine se termine barbelés sera plus grande dans le côté du cône de croissance vers la micropipette 10 .
Cônes de croissance sont des structures à petites cellules et délicat. Les procédures de perméabilisation, la rhodamine-actine incorporation, la fixation et la visualisation de fluorescence sont tous soigneusement fait et peut être menée sur la scène d'un microscope inversé. Ces méthodes peuvent être appliquées à l'étude de polymérisation de l'actine locale dans les neurones en migration, d'autres cellules des tissus primaires ou de lignées cellulaires.
Protocole
Pour la rhodamine-actine étiquetage, les neurones sont cultivées sur des lamelles en verre placé dans le fond de 35 mm plats en plastique, ou sur des lamelles collées dans "vidéo" plats.
1. Préparation des Lamelles ou "Video" Plats
- Beaucoup de types de neurones sont mal adhésif pour substrats in vitro. Lamelles de verre, qui sont requis pour cette procédure, ne permettent pas suffisamment de neurones substrat d'adhésion sauf si elles sont convenablement nettoyés et préparés. Une procédure détaillée pour l'acide lavage et de nettoyage des lamelles en verre est décrite dans les cellules nerveuses de l'ouvrage Cu....
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Discussion
Les méthodes présentées ici permettent la résolution temporelle et spatiale des composants cellulaires qui sont impliquées dans le remodelage dynamique du cytosquelette d'actine à la marge de premier plan de migration des cônes de croissance. L'action des molécules attractives, comme le NGF ou nétrine, de stimuler rapidement filaments d'actine de polymérisation se révèle comme une augmentation locale de l'actine se termine barbelés, créé par filaments d'actine séparation par activées ADF / cofiline <.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Les auteurs remercient le Dr James Bamburg et des membres de son laboratoire pour la collaboration dans ces études. Ce travail a été financé par des subventions du NIH HD19950, EY07133 et par des subventions de la Fondation Minnesota Medical.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Couvre-objet 18x18 mm | Gold Seal | 3305 | |
| Boîtes de Pétri de 35 mm | Falcon BD | 351008 | |
| Ciment pour aquarium | DAP 100% silicone aquarium sealant | N'importe quel magasin de bricolage | |
| Poly-D-lysine (pm > 300 000) | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Laminine naturelle de souris | Invitrogen | 23017-015 | |
| L1 CAM | R&D Systems | 777-NC | |
| Phalloïdine Alexa-fluor 350 | Invitrogen | A22281 | |
| Actine non musculaire marquée rhodamine | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | |
| Milieu de culture F12 | Invitrogen | 21700-075 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
Références
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Letourneau, P. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Oxford. 1139-1145 (2008).
- Kalil, K., Dent, E. ....
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Réimpressions et autorisations
