Mekanisk stimulering av stamceller Använda Cykliska enaxlig Strain
Summary
Det är allmänt känt att mekaniska krafter i kroppen kan påverka celldifferentiering och spridning. Här presenterar vi en video protokoll som visar användningen av en specialbyggd bioreaktor för att leverera enaxlig belastning cykliska drag till stamceller odlade på flexibla micropatterned substrat.
Abstract
Roll mekaniska krafter i utveckling och underhåll av biologiska vävnader är väl dokumenterat, bland annat flera mekaniskt reglerade företeelser som benremodellering, muskulös hypertrofi och glatt muskulatur cell plasticitet. Men de inblandade krafterna är ofta oerhört komplexa och svåra att övervaka och styra in vivo. För att bättre undersöka effekterna av mekaniska krafter på celler har vi utvecklat en in vitro-metod för tillämpning av enaxlig belastning cykliska drag att anhängare celler odlade på elastiskt membran. Denna metod använder en specialdesignad bioreaktor med en motordriven kam-rotor för att tillämpa önskad kraft. Här presenterar vi en steg-för-steg video protokoll visar hur man monterar de olika komponenterna i varje "stretch kammare", även i detta fall, en silikon membran med micropatterned topografi att orientera cellerna med ledning av stammen. Vi beskriver även förfaranden för sterilisering av kamrarna, sådd celler på membranet, låsning kammaren i bioreaktor, och justering av mekaniska parametrar (dvs. storlek och graden av ansträngning). De förfaranden som beskrivs i detta protokoll är specifika för sådd mänskliga mesenkymala stamceller på silikon membran med 10 mikrometer breda kanaler orienterade parallellt med riktningen av påfrestningar. Men de metoder och material som presenteras i detta system är flexibla nog att rymma ett antal variationer på detta tema: töjningshastighet, omfattning, varaktighet, celltyp, membran topografi, membran beläggning, etc. allt anpassas till önskat program eller resultat. Detta är en robust metod för att undersöka effekterna av enaxlig drag stam tillämpas på celler in vitro.
Protocol
Discussion
Banes et al. först rapporterade användning av ett system för mekanisk stimulering av celler in vitro med hjälp av en flexibel elastomerisk substrat för att leverera mekanisk kraft till celler 1. Sedan dess har många variationer på denna design tagits fram och utnyttjas. Flera mekaniska stretch-system finns kommersiellt tillgängliga under namnet "Flexercell" (Flexcell International Corp), medan vissa laboratorier använder specialbyggda enheter. I den här videon protokoll vi har beskrivit installationen och anv?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fungizone | Reagent | Lonza | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | Gibco | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | Gibco | 11966-025 |
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
