מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לכמת את טרנסלוקציה של GLUT4 מן הציטופלסמה אל קרום התא של תאים על ידי cytometry הזרימה.
Abstract
הגלוקוז הוא המקור העיקרי של אנרגיה לגוף, הדורשים ויסות מתמיד של הריכוז בדם שלה. שחרור אינסולין על ידי הלבלב גורם ספיגת הגלוקוז על ידי רקמות רגישות לאינסולין, בעיקר את המוח, שרירי השלד, וכן adipocytes. חולים שסובלים מסוכרת מסוג 2 ו / או השמנת יתר לעיתים קרובות לפתח עמידות לאינסולין אינם מסוגלים לשלוט הומאוסטזיס הגלוקוז שלהם. תובנות חדשות על מנגנוני עמידות לאינסולין עשויים לספק אסטרטגיות טיפול חדש לסוכרת מסוג 2.
משפחת שפע של מובילי הגלוקוז מורכב מחברי thirteen מופץ על רקמות שונות בגוף 1. טרנספורטר הגלוקוז סוג 4 (GLUT4) הוא טרנספורטר העיקריים מתווכת ספיגת הגלוקוז על ידי רקמות רגישות לאינסולין כמו שריר השלד. עם קשירה של אינסולין לקולטן שלו, שלפוחית המכילה GLUT4 translocate מן הציטופלסמה אל קרום התא, וגורם ספיגת הגלוקוז. צמצום GLUT4 טרנסלוקציה היא אחת הסיבות תנגודת לאינסולין סוג 2 סוכרת 2,3.
טרנסלוקציה של GLUT4 מן הציטופלסמה אל קרום התא ניתן דמיינו ידי immunocytochemistry, באמצעות fluorophore-מצומדות GLUT4 נוגדנים ספציפיים.
כאן אנו מתארים טכניקה לכמת סך של טרנסלוקציה GLUT4 קרום הפלזמה של תאים במהלך משך הנבחר, באמצעות cytometry הזרימה. פרוטוקול זה הוא מהיר (פחות מ 4 שעות, כולל דגירה עם אינסולין) ומאפשר ניתוח של כמה כמו 3000 או תאים רבים ככל 1,000,000 תאים לכל תנאי בניסוי יחיד. היא מסתמכת על אנטי GLUT4 נוגדנים להפנות epitope חיצוני של המשלח אשר נקלטות על ידי אותה ברגע זה נחשף המדיום תאיים לאחר טרנסלוקציה על קרום התא.
Protocol
Discussion
אנחנו הוכיחו טכניקה מהירה לכימות טרנסלוקציה של GLUT4 מן הציטופלסמה אל קרום הפלזמה של תאים על ידי cytometry הזרימה.
GLUT4 מתבטאת רק transiently על קרום התא של תאים הוא endocytosed. מאז נוגדנים מחויב להישאר צמודים GLUT4, אפילו במהלך אנדוציטוזה, האות הקרינה נותן את הסכום הכולל של GLUT4 כי נחשף הקרום פלזמה במהלך תקופת הדגירה של נבחר בנוכחות של אינסולין.
טכניקה זו יכולה לחול גם על לימוד טרנסלוקציה של חלבונים אחרים בתא תאיים על ממברנת פלזמה, ובלבד נוגדן טוב להפנות epitope חיצוני של החלבון עניין זמין. לדוגמה, assay דומה כיום נפוץ כדי להעריך את שיעור degranulation ציטוטוקסיות של לימפוציטים מסוג T ו לימפוציטים הרוצח טבעי על ידי מדידת טרנסלוקציה של CD107a אל הממברנה הפלסמטית 4,5 שלהם. טרנסלוקציה של phosphatidylserine מהצד הפנימי של קרום התא אל הצד החיצוני במהלך האפופטוזיס התא או נמק יכול גם להתגלות על ידי cytometry זרימה, באמצעות fluorophore שכותרתו Annexin V 6.
מלבד המהירות של assay, cytometry זרימה מציג את היתרון המאפשר לימוד של טרנסלוקציה חלבון קרום התא פלזמה באוכלוסיות מעורבות. אכן, אפשר לשלב מכתים עבור סמנים משנה התא לחלבון של עניין, ואחריו רכישת נתונים על cytometer רב לייזר זרימה 7.
כמויות של נוגדנים שניתן בסעיף 1.2 של פרוטוקול הם נקודת התחלה: אנו ממליצים לכיל הנוגדנים שלך עם תאים העניין שלך כדי לקבוע את ריכוז הנוגדן המינימום שנותן לך אות מקסימלית. מגוון התחלה טובה הנוגדן אנטי אנושי ראשוני GLUT4 השתמשנו כאן יהיה μL 1-10 לכל שפופרת (כלומר 0.2-2 נוגדן מיקרוגרם לכל צינור), כל צינור המכיל לא יותר מ 1 מיליון תאים. עבור נוגדנים ראשוניים אחרים, עיין בהוראות של הספק.
נורמליזציה של הנתונים כנדרש autofluorescence של תאים ישתנו מתורם לתורם ו מניסוי לניסוי.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של קליפורד הגברת זקן לבן גרהם נתרמו לקרן מחקר ה-NIH (AR059838) ל CB, מ-NIH (AR052791, AR044387-ערה, & NS063298) כדי LTT, ועל ידי במכללת ביילור לרפואה cytometry ו-Cell מיון Core במימון ה-NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, P30CA125123 & NCI). התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anti-human GLUT4 antibodies | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1606 | Against an external epitope of GLUT4 | |
| Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 | Invitrogen | A-21467 | ||
| Recombinant human insulin | Sigma | I2643 | ||
| Cell lifters | VWR | 29942-118 | Cut to fit the wells | |
| 5 ml tubes for FACS | VWR | 60819-138 | Fit all BD machines |
References
- Zhao, F. Q., Keating, A. F. Functional properties and genomics of glucose transporters. Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).
- Karnieli, E., Armoni, M. Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology. Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).
- Graham, T. E., Kahn, B. B. Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes. Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77, 705-713 (2010).
