Respirometric تقييم الفسفرة المؤكسدة في سابونين - permeabilized ألياف القلب
Summary
سابونين – permeabilized إعداد الألياف بالتزامن مع تحليل respirometric الفسفرة المؤكسدة يوفر تقييم تكاملية وظيفة الميتوكوندريا. يمكن تنفس الميتوكوندريا في الدول الفيزيولوجية المرضية وتعكس التأثيرات التنظيمية المختلفة بما في ذلك التفاعلات الميتوكوندريا ، مورفولوجيا والكيمياء الحيوية.
Abstract
التحقيق في وظيفة الميتوكوندريا يمثل معيارا هاما للفسيولوجيا القلب كما تشارك في استقلاب الميتوكوندريا والطاقة ، والاكسدة ، موت الخلايا المبرمج ، والشيخوخة ، encephalomyopathies الميتوكوندريا وسمية المخدرات. ونظرا لهذا ، والتقنيات لقياس وظيفة القلب الميتوكوندريا هي في الطلب. أسلوب واحد أن يعمل هذا النهج التكاملي لقياس وظيفة الميتوكوندريا هي respirometric الفسفرة المؤكسدة (OXPHOS) التحليل.
يتمحور مبدأ تقييم OXPHOS respirometric حول قياس تركيز الأوكسجين الاستفادة من وجود القطب كلارك. كما يستهلك حزمة الألياف permeabilized تركيز الأكسجين الأكسجين ، وانخفاض في غرفة مغلقة. المعايرة باستخدام بروتوكولات مختارة الركيزة – مانع uncoupler ، يتم توفير الإلكترونات إلى مواقع محددة من سلسلة نقل الإلكترون ، مما يسمح للتقييم وظيفة الميتوكوندريا. وتستخدم تقنيات لتحليل التحضيرية التي تسبق respirometric وظيفة الميتوكوندريا والميكانيكية والكيميائية لpermeabilize في غمد الليف العضلي من ألياف العضلات. permeabilization الكيميائية تستخدم لثقب انتقائي سابونين غشاء الخلية مع الحفاظ على الهيكل الخلوي.
هذه الورقة توضح بدقة الخطوات المتبعة في إعداد سابونين البشرة ألياف القلب لقياس استهلاك الأوكسجين لتقييم OXPHOS الميتوكوندريا. بالإضافة إلى ذلك ، حل المشاكل ، وكذلك تقديم المشورة ركائز محددة ، ويتم توفير مثبطات uncouplers التي يمكن استخدامها لتحديد وظيفة الميتوكوندريا في مواقع محددة من سلسلة نقل الإلكترون. الأهم من ذلك ، قد يكون وصف بروتوكول تطبيقها بسهولة على أنسجة القلب والهيكل العظمي من مختلف النماذج الحيوانية وعينات الإنسان.
Protocol
Discussion
وسابونين – permeabilized تقنية الألياف القلبية يقدم حلا وسطا بين فريد في المختبر والمجراة في تقييم الميتوكوندريا من استهلاك الأوكسجين OXPHOS. تشمل زيادة مزايا هذه التقنية أهمية فسيولوجية مقارنة الميتوكوندريا المعزولة والعمارة الخليوي هي الحفاظ عليها. في حين أن غشاء الب…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة وكندا الجينوم. JS يحمل جوائز دعم راتب من مؤسسة التراث ألبرتا للأبحاث الطبية ، والقلب والسكتة الدماغية مؤسسة كندا وجمعية السكري الكندية. والمختبر أن نعترف المساعدة التقنية من آلات Oroboros خلال الاستحواذ على تقنية الألياف سابونين – permeabilized.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | ||
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma | A5285 | ||
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma | A-6003 | ||
| Antimycin A | Sigma | A8674 | ||
| Ascobic acid | Sigma | A4403 | ||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | ||
| Atractyloside | Sigma | A6882 | ||
| Calcium carbonate | Sigma | C4830 | ||
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Cytochrome c | Sigma | C7752 | ||
| Digitonin | Sigma | D141 | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D9779 | ||
| Ethylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | ||
| Glutamic acid | Sigma | 27647 | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | ||
| Imidazole | Sigma | I5513 | ||
| Ketamine | Pfizer | Ketaset | ||
| Lactobionic acid | Sigma | 153516 | ||
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M9272 | ||
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma | M9272 | ||
| Malic acid | Sigma | M1000 | ||
| MES | Sigma | M3671 | ||
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma | T3134 | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | ||
| Potassium Hydroxide | Sigma | P5958 | ||
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Rotenone | Sigma | R8875 | ||
| Saponin | Sigma | 47036 | ||
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
| Succinic acid | Sigma | S3674 | ||
| Sucrose | Sigma | S7903 | ||
| Taurine | Sigma | T8691 | ||
| Xylazine | Bayer | Rompun | ||
| ddH2O | ||||
| Ice | ||||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | |||
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | ||
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-368 | ||
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-364 | ||
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | ||
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | ||
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | ||
| Sterile Surgical Blade | VWR | BD371610 | ||
| 0.45-μm Syringe filters | VWR | CA28145-485 | ||
| pH meter | VWR | CA11388-308 | ||
| Glass Petri dishes | VWR | 89000-300 | ||
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR | 82050-926 | ||
| Plate Stirrer | VWR | 97042-594 | ||
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | ||
| Weigh Scale | VWR | CA11278-162 | ||
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | ||
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | ||
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | ||
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | ||
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR | 89106-750 | ||
| Dissecting Microscope | Olympus |
References
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S., Heldmaier, G., Klingenspor, M. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. , 431-442 (2000).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).
- Visscher, G. D. e., Rooker, S., Jorens, P. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 .
- Sena, S., Hu, P., Zhang, D. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).
- Boudina, S., Sena, S., O’Neill, B. T. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation. 112, 2686-2695 (2005).
- Lenaz, G., Genova, M. L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 .
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- O, . Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).
- Endo, M., Kitazawa, T., Morad, M. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. , 307-327 (1978).
- Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).
- Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. , 196-952 (1962).
- Daum, G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).
- Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).
- Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R., Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). What is Controlling Life?. , 268-271 (1994).
- Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors. 7, 221-223 (1998).
- Gnaiger, E., Dykens, J., Will, Y. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. , 327-352 (2008).
