Respirométriques évaluation phosphorylation oxydative dans la saponine perméabilisées fibres cardiaques
Summary
Préparation des fibres perméabilisées saponine en conjonction avec l'analyse de phosphorylation oxydative respirométriques fournit une évaluation intégrative de la fonction mitochondriale. Respiration mitochondriale dans les états physiologiques et pathologiques peuvent refléter diverses influences réglementaires, y compris les interactions des mitochondries, la morphologie et la biochimie.
Abstract
Enquête sur la fonction mitochondriale représente un paramètre important de la physiologie cardiaque que les mitochondries sont impliquées dans le métabolisme énergétique, le stress oxydatif, l'apoptose, le vieillissement, encéphalomyopathies mitochondriale et la toxicité des médicaments. Dans ce contexte, les technologies pour mesurer la fonction mitochondriale cardiaques sont en demande. Une technique qui emploie une approche intégrative pour mesurer la fonction mitochondriale est respirométriques phosphorylation oxydative (OXPHOS) analyse.
Le principe de l'évaluation OXPHOS respirométriques est centrée autour de la mesure de la concentration en oxygène en utilisant une électrode de Clark. Comme le faisceau de fibres perméabilisées consomme l'oxygène concentration en oxygène, dans les baisses de chambre fermée. En utilisant des protocoles de titration sélectionnée substrat-inhibiteur découplant, les électrons sont fournis à des sites spécifiques de la chaîne de transport d'électrons, ce qui permet l'évaluation de la fonction mitochondriale. Avant l'analyse respirométriques de la fonction mitochondriale, mécaniques et chimiques des techniques de préparation sont utilisées pour perméabiliser le sarcolemme des fibres musculaires. Perméabilisation chimique emploie saponine de façon sélective perforer la membrane cellulaire tout en conservant l'architecture cellulaire.
Ce document décrit en détail les étapes impliquées dans la préparation de saponine peau fibres cardiaques pour mesurer la consommation d'oxygène afin d'évaluer OXPHOS mitochondriale. De plus, le dépannage des conseils ainsi que des substrats spécifiques, les inhibiteurs et découpleurs qui peuvent être utilisées pour déterminer la fonction des mitochondries dans des sites spécifiques de la chaîne de transport d'électrons sont fournis. Fait important, le protocole décrit peut être facilement appliquée à des tissus cardiaques et squelettiques de divers modèles animaux et des échantillons humains.
Protocol
Discussion
La technique de la saponine perméabilisées fibres cardiaques offre un compromis unique entre in vitro et de vivo l'évaluation de la consommation d'oxygène des mitochondries OXPHOS. Avantages de cette technique comprennent une augmentation pertinence physiologique par rapport aux mitochondries isolées de l'architecture cellulaire est préservée. Alors que la membrane plasmique est dégradé, les structures membranaires intracellulaires, y compris 12 des mitochondries, 1…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par les Instituts canadiens de recherche en santé et Génome Canada. JS détient bourses d'aide salariale de l'Alberta Heritage Foundation for Medical Research, Heart and Stroke Foundation du Canada et l'Association canadienne du diabète. Le laboratoire tient à souligner l'aide technique des instruments Oroboros lors de l'acquisition de la technique des fibres perméabilisées saponine.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | ||
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma | A5285 | ||
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma | A-6003 | ||
| Antimycin A | Sigma | A8674 | ||
| Ascobic acid | Sigma | A4403 | ||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | ||
| Atractyloside | Sigma | A6882 | ||
| Calcium carbonate | Sigma | C4830 | ||
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Cytochrome c | Sigma | C7752 | ||
| Digitonin | Sigma | D141 | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D9779 | ||
| Ethylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | ||
| Glutamic acid | Sigma | 27647 | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | ||
| Imidazole | Sigma | I5513 | ||
| Ketamine | Pfizer | Ketaset | ||
| Lactobionic acid | Sigma | 153516 | ||
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M9272 | ||
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma | M9272 | ||
| Malic acid | Sigma | M1000 | ||
| MES | Sigma | M3671 | ||
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma | T3134 | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | ||
| Potassium Hydroxide | Sigma | P5958 | ||
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Rotenone | Sigma | R8875 | ||
| Saponin | Sigma | 47036 | ||
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
| Succinic acid | Sigma | S3674 | ||
| Sucrose | Sigma | S7903 | ||
| Taurine | Sigma | T8691 | ||
| Xylazine | Bayer | Rompun | ||
| ddH2O | ||||
| Ice | ||||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | |||
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | ||
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-368 | ||
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-364 | ||
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | ||
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | ||
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | ||
| Sterile Surgical Blade | VWR | BD371610 | ||
| 0.45-μm Syringe filters | VWR | CA28145-485 | ||
| pH meter | VWR | CA11388-308 | ||
| Glass Petri dishes | VWR | 89000-300 | ||
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR | 82050-926 | ||
| Plate Stirrer | VWR | 97042-594 | ||
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | ||
| Weigh Scale | VWR | CA11278-162 | ||
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | ||
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | ||
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | ||
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | ||
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR | 89106-750 | ||
| Dissecting Microscope | Olympus |
References
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