הערכה Respirometric זרחון חמצוני ב-Saponin permeabilized סיבים לב
Summary
Saponin-permeabilized הכנה סיבים בשילוב עם ניתוח respirometric זרחון חמצוני מספק הערכה אינטגרטיבית של תפקוד המיטוכונדריה. הנשימה מיטוכונדריאלי במדינות פיזיולוגיים ופתולוגיים יכול לשקף השפעות רגולטוריות שונות, כולל אינטראקציות המיטוכונדריה, מורפולוגיה וביוכימיה.
Abstract
חקירת תפקוד המיטוכונדריה מהווה פרמטר חשוב בפיזיולוגיה של הלב כמו המיטוכונדריה מעורבים במטבוליזם של אנרגיה, סטרס חמצוני, אפופטוזיס, הזדקנות, encephalomyopathies המיטוכונדריה רעילות התרופה. לאור זאת, טכנולוגיות למדוד תפקוד המיטוכונדריה לב יש ביקוש. אחת הטכניקות המעסיקה גישה אינטגרטיבית למדוד תפקוד המיטוכונדריה היא respirometric ניתוח חמצוני (OXPHOS) זירחון.
עקרון הערכה OXPHOS respirometric מושתתת על מדידת ריכוז החמצן ניצול אלקטרודה קלארק. כמו חבילת סיבי permeabilized צורכת חמצן, ריכוז החמצן יורדת לחדר סגור. שימוש נבחר מצע מעכבי-uncoupler פרוטוקולים טיטרציה, האלקטרונים ניתנים אתרים ספציפיים של שרשרת הובלת האלקטרונים, המאפשר הערכה של תפקוד המיטוכונדריה. טכניקות הכנה לפני ניתוח respirometric של תפקוד המיטוכונדריה, מכני וכימי מנוצלים permeabilize sarcolemma של סיבי שריר. Permeabilization כימית מעסיקה saponin סלקטיבי לנקב את קרום התא, תוך שמירה על הארכיטקטורה התאית.
מאמר זה מתאר את השלבים ביסודיות מעורבים בהכנת saponin עור סיבי לב עבור מדידות צריכת החמצן להעריך OXPHOS המיטוכונדריה. בנוסף, פתרון בעיות עצה כמו גם מצעים ספציפי, מעכבי ו uncouplers כי ניתן להשתמש כדי לקבוע את תפקוד המיטוכונדריה באתרים ספציפיים של שרשרת הובלת האלקטרונים מסופקים. חשוב לציין, פרוטוקול המתואר ניתן ליישם בקלות ברקמת הלב ואת השלד של מודלים של בעלי חיים שונים דגימות אנושיות.
Protocol
Discussion
הטכניקה saponin-permeabilized סיבים לב מציעה פשרה ייחודית בין במבחנה vivo הערכה של צריכת OXPHOS המיטוכונדריה חמצן. היתרונות של שיטה זו כוללים גדל רלוונטיות פיזיולוגיים לעומת המיטוכונדריה מבודד כמו ארכיטקטורה הסלולר נשמרת. בעוד הממברנה הפלסמטית נפגעת, מבנים תאיים קרום המיטוכ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי מכוני הבריאות הקנדי למחקר הגנום קנדה. JS מחזיק תמיכה משכורת פרסים מן המורשת אלברטה קרן למחקר רפואי לב, ושבץ קרן של קנדה איגוד הסוכרת הקנדית. המעבדה רוצה להכיר סיוע טכני של מכשירים Oroboros במהלך רכישת טכניקה saponin-permeabilized סיבים.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | ||
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma | A5285 | ||
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma | A-6003 | ||
| Antimycin A | Sigma | A8674 | ||
| Ascobic acid | Sigma | A4403 | ||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | ||
| Atractyloside | Sigma | A6882 | ||
| Calcium carbonate | Sigma | C4830 | ||
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Cytochrome c | Sigma | C7752 | ||
| Digitonin | Sigma | D141 | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D9779 | ||
| Ethylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | ||
| Glutamic acid | Sigma | 27647 | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | ||
| Imidazole | Sigma | I5513 | ||
| Ketamine | Pfizer | Ketaset | ||
| Lactobionic acid | Sigma | 153516 | ||
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M9272 | ||
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma | M9272 | ||
| Malic acid | Sigma | M1000 | ||
| MES | Sigma | M3671 | ||
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma | T3134 | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | ||
| Potassium Hydroxide | Sigma | P5958 | ||
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Rotenone | Sigma | R8875 | ||
| Saponin | Sigma | 47036 | ||
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
| Succinic acid | Sigma | S3674 | ||
| Sucrose | Sigma | S7903 | ||
| Taurine | Sigma | T8691 | ||
| Xylazine | Bayer | Rompun | ||
| ddH2O | ||||
| Ice | ||||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | |||
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | ||
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-368 | ||
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-364 | ||
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | ||
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | ||
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | ||
| Sterile Surgical Blade | VWR | BD371610 | ||
| 0.45-μm Syringe filters | VWR | CA28145-485 | ||
| pH meter | VWR | CA11388-308 | ||
| Glass Petri dishes | VWR | 89000-300 | ||
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR | 82050-926 | ||
| Plate Stirrer | VWR | 97042-594 | ||
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | ||
| Weigh Scale | VWR | CA11278-162 | ||
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | ||
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | ||
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | ||
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | ||
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR | 89106-750 | ||
| Dissecting Microscope | Olympus |
References
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S., Heldmaier, G., Klingenspor, M. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. , 431-442 (2000).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).
- Visscher, G. D. e., Rooker, S., Jorens, P. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 .
- Sena, S., Hu, P., Zhang, D. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).
- Boudina, S., Sena, S., O’Neill, B. T. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation. 112, 2686-2695 (2005).
- Lenaz, G., Genova, M. L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 .
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- O, . Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).
- Endo, M., Kitazawa, T., Morad, M. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. , 307-327 (1978).
- Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).
- Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. , 196-952 (1962).
- Daum, G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).
- Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).
- Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R., Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). What is Controlling Life?. , 268-271 (1994).
- Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors. 7, 221-223 (1998).
- Gnaiger, E., Dykens, J., Will, Y. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. , 327-352 (2008).
