Saponin-проницаемыми волокна подготовки в сочетании с respirometric окислительного фосфорилирования обеспечивает анализ интегративной оценки митохондриальной функции. Митохондриальная дыхания в физиологических и патологических состояний могут отражать различные регуляторных влияний в том числе митохондриальных взаимодействий, морфологии и биохимии.
Исследование функции митохондрий, представляет собой важный параметр сердечной физиологии митохондрий принимают участие в энергетическом обмене, окислительный стресс, апоптоз, старение, митохондриальная encephalomyopathies и токсичности препаратов. Учитывая это, технологий для измерения сердечной функции митохондрий, пользуются спросом. Один из методов, который использует комплексный подход для оценки митохондриальной функции respirometric окислительного фосфорилирования (OXPHOS) анализа.
Принцип оценки respirometric OXPHOS сосредоточена вокруг измерения концентрации кислорода использованием электрода Кларка. Как проницаемыми расслоение потребляет кислород, концентрация кислорода в закрытой камере снижается. Использование выбранный субстрат-ингибитор-разобщающий агент протоколов титрования, электроны предоставляются участки, специально предназначенные электрон-транспортной цепи, позволяющие оценки митохондриальной функции. До respirometric анализ митохондриальной функции, механические и химические методы подготовительных используются для permeabilize сарколеммы мышечных волокон. Химическая пермеабилизации работают сапонин выборочно перфорировать мембраны клетки, сохраняя при этом сотовая архитектура.
Эта статья полностью описывает шаги, связанные с подготовкой сапонин кожей сердечных волокон для измерения потребления кислорода для оценки митохондриальной OXPHOS. Кроме того, устранение неполадок консультации, а также специфических субстратов, ингибиторов и разобщители, которые могут быть использованы для определения функции митохондрий в определенных участков электрон-транспортной цепи предоставляются. Важно отметить, что описанный протокол может быть легко применить к сердечной и скелетной ткани различных моделей животных и человека образцов.
Сапонин-проницаемыми сердечной техника волокна предлагает уникальный компромисс между в пробирке и в естественных оценки митохондриальной потребления кислорода OXPHOS. Преимущества этого метода включают повышенную физиологическую значимость по сравнению с изолированными м…
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при поддержке Канадского института исследований в области здравоохранения и Геном Канада. JS имеет зарплату поддержки награды от Альберта Heritage Foundation медицинских исследований сердца и инсульта фонда Канады и Канадской Ассоциации Диабета. Лаборатория хотел бы выразить признательность технической помощи инструментов Oroboros при приобретении сапонин-проницаемыми волокна техники.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | ||
70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | ||
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma | A5285 | ||
Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma | A-6003 | ||
Antimycin A | Sigma | A8674 | ||
Ascobic acid | Sigma | A4403 | ||
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | ||
Atractyloside | Sigma | A6882 | ||
Calcium carbonate | Sigma | C4830 | ||
Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
Cytochrome c | Sigma | C7752 | ||
Digitonin | Sigma | D141 | ||
Dithiothreitol | Sigma | D9779 | ||
Ethylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | ||
Glutamic acid | Sigma | 27647 | ||
HEPES | Sigma | H4034 | ||
Imidazole | Sigma | I5513 | ||
Ketamine | Pfizer | Ketaset | ||
Lactobionic acid | Sigma | 153516 | ||
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M9272 | ||
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma | M9272 | ||
Malic acid | Sigma | M1000 | ||
MES | Sigma | M3671 | ||
N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma | T3134 | ||
Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ||
Potassium Chloride | Sigma | P9541 | ||
Potassium Hydroxide | Sigma | P5958 | ||
Potassium cyanide | Fluka | 60178 | ||
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
Rotenone | Sigma | R8875 | ||
Saponin | Sigma | 47036 | ||
Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
Succinic acid | Sigma | S3674 | ||
Sucrose | Sigma | S7903 | ||
Taurine | Sigma | T8691 | ||
Xylazine | Bayer | Rompun | ||
ddH2O | ||||
Ice | ||||
Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | |||
Kimwipes | VWR | 21905-026 | ||
15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-368 | ||
50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-364 | ||
Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | ||
Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | ||
Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | ||
Sterile Surgical Blade | VWR | BD371610 | ||
0.45-μm Syringe filters | VWR | CA28145-485 | ||
pH meter | VWR | CA11388-308 | ||
Glass Petri dishes | VWR | 89000-300 | ||
12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR | 82050-926 | ||
Plate Stirrer | VWR | 97042-594 | ||
Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | ||
Weigh Scale | VWR | CA11278-162 | ||
10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | ||
25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | ||
50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | ||
Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | ||
Polystyrene Weighing Dishes | VWR | 89106-750 | ||
Dissecting Microscope | Olympus |