Respirometric oxidativ fosforylering Bedömning i Saponin-permeabilized Cardiac Fibrer
Summary
Saponin-permeabilized fiber förberedelser i samband med respirometric oxidativ fosforylering analys ger integrerad bedömning av mitokondriell funktion. Mitokondriell andning i fysiologiska och patologiska tillstånd kan spegla olika rättsliga influenser inklusive mitokondriella interaktioner, morfologi och biokemi.
Abstract
Utredning av mitokondriell funktion är en viktig parameter för hjärt fysiologi som mitokondrierna är involverade i energiomsättningen, oxidativ stress, apoptos, åldrande, mitokondrie encephalomyopathies och läkemedelstoxicitet. Med tanke på detta, teknik för att mäta hjärtats funktion i mitokondrierna är i efterfrågan. En teknik som använder en integrerad strategi för att mäta mitokondriefunktion är respirometric oxidativ fosforylering (OXPHOS) analys.
Principen om respirometric OXPHOS bedömning är centrerad kring att mäta syrehalten använda en Clark-elektrod. Som permeabilized fibern bunt förbrukar syre, syrehalt i sluten kammare minskar. Använda utvalda substrat-hämmare-uncoupler titrering protokoll, är elektroner ges till specifika platser i elektron transportkedjan, som möjliggör utvärdering av mitokondriell funktion. Innan respirometric analyser av mitokondriell funktion, mekaniska och kemiska förberedande tekniker utnyttjas för att permeabilize de sarcolemma av muskelfibrerna. Kemisk permeabilization sysselsätter saponin att selektivt perforera cellmembranet bibehållen cellulär arkitektur.
Detta dokument beskriver grundligt de steg som ingår i förberedelserna saponin skal hjärt fibrer för mätningar syreförbrukning att utvärdera mitokondriella OXPHOS. Dessutom, felsökning rådgivning samt särskilda substrat, är hämmare och uncouplers som kan användas för att bestämma mitokondrierna fungera på vissa ställen av elektronens transportkedjan tillhandahålls. Viktigt kan beskrivas protokollet lätt appliceras på hjärt-och skelettmuskler vävnad av olika djurmodeller och mänskliga prover.
Protocol
Discussion
Den saponin-permeabilized hjärt fiber tekniken erbjuder en unik kompromiss mellan in vitro och in vivo utvärdering av mitokondrie OXPHOS syreförbrukning. Fördelar med denna teknik är bland annat ökad fysiologisk betydelse i jämförelse med isolerade mitokondrier som cellulära arkitektur är bevarad. Medan plasmamembran bryts ned, intracellulära membran strukturer inklusive mitokondrierna 12, 14, sarkoplasmatiska nätmagen 14, myofilamenten och cytoskelettet 1, 17</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research och Genome Canada. JS har utmärkelser lön stöd från Alberta Heritage Foundation för medicinsk forskning, Hjärt-och Stroke Foundation i Kanada och den kanadensiska Diabetes Association. Laboratoriet vill tacka för det tekniska biståndet till Oroboros Instrument under förvärvet av saponin-permeabilized fiber teknik.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | ||
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma | A5285 | ||
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma | A-6003 | ||
| Antimycin A | Sigma | A8674 | ||
| Ascobic acid | Sigma | A4403 | ||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | ||
| Atractyloside | Sigma | A6882 | ||
| Calcium carbonate | Sigma | C4830 | ||
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Cytochrome c | Sigma | C7752 | ||
| Digitonin | Sigma | D141 | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D9779 | ||
| Ethylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | ||
| Glutamic acid | Sigma | 27647 | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | ||
| Imidazole | Sigma | I5513 | ||
| Ketamine | Pfizer | Ketaset | ||
| Lactobionic acid | Sigma | 153516 | ||
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M9272 | ||
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma | M9272 | ||
| Malic acid | Sigma | M1000 | ||
| MES | Sigma | M3671 | ||
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma | T3134 | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | ||
| Potassium Hydroxide | Sigma | P5958 | ||
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Rotenone | Sigma | R8875 | ||
| Saponin | Sigma | 47036 | ||
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
| Succinic acid | Sigma | S3674 | ||
| Sucrose | Sigma | S7903 | ||
| Taurine | Sigma | T8691 | ||
| Xylazine | Bayer | Rompun | ||
| ddH2O | ||||
| Ice | ||||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | |||
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | ||
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-368 | ||
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-364 | ||
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | ||
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | ||
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | ||
| Sterile Surgical Blade | VWR | BD371610 | ||
| 0.45-μm Syringe filters | VWR | CA28145-485 | ||
| pH meter | VWR | CA11388-308 | ||
| Glass Petri dishes | VWR | 89000-300 | ||
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR | 82050-926 | ||
| Plate Stirrer | VWR | 97042-594 | ||
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | ||
| Weigh Scale | VWR | CA11278-162 | ||
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | ||
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | ||
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | ||
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | ||
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR | 89106-750 | ||
| Dissecting Microscope | Olympus |
References
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S., Heldmaier, G., Klingenspor, M. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. , 431-442 (2000).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).
- Visscher, G. D. e., Rooker, S., Jorens, P. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 .
- Sena, S., Hu, P., Zhang, D. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).
- Boudina, S., Sena, S., O’Neill, B. T. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation. 112, 2686-2695 (2005).
- Lenaz, G., Genova, M. L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 .
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- O, . Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).
- Endo, M., Kitazawa, T., Morad, M. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. , 307-327 (1978).
- Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).
- Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. , 196-952 (1962).
- Daum, G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).
- Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).
- Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R., Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). What is Controlling Life?. , 268-271 (1994).
- Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors. 7, 221-223 (1998).
- Gnaiger, E., Dykens, J., Will, Y. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. , 327-352 (2008).
