Dissection de l'homme des éléments du corps vitré de l'analyse protéomique

Summary

Cette vidéo montre une technique efficace pour différencier et disséquer les différentes structures de semi-transparente du corps humain vitreuse en post mortem yeux.

Abstract

Le vitré est une optiquement clair, matrice de collagène extracellulaire qui remplit l'intérieur de l'œil et recouvre la rétine. ^1,2 interactions anormales entre les sous-structures vitré et la rétine sous-tendent plusieurs maladies vitréo-rétinienne, y compris la déchirure de la rétine et le détachement, plissement maculaire, trou maculaire, liée à l'âge de traction vitréo dégénérescence maculaire, vitréorétinopathie proliférante, rétinopathie diabétique proliférative, et vitreoretinopathies hérité. ^1,2 La composition moléculaire des sous-structures vitreuses n'est pas connue. Puisque le corps vitré est transparent avec accès chirurgical limité, il a été difficile à étudier ses sous-structures au niveau moléculaire. Nous avons développé une méthode permettant de séparer et de préserver ces tissus pour l'analyse protéomique et biochimique. La technique de dissection dans cette vidéo expérimentale montre comment isoler base du vitré, hyaloïde antérieure, le noyau vitreux, et le cortex vitré de l'autopsie yeux humains. Unidimensionnelle SDS-PAGE des analyses de chaque composant du vitré a montré que notre technique de dissection donné lieu à quatre profils protéiques unique correspondant à chaque sous-structure du vitré humain. Identification de protéines différentiellement compartimentée révélera molécules candidates qui sous-tendent diverses maladies vitréo-rétinienne.

Protocol

1. Dissection du segment antérieur.

1. La cornée est enlevée en faisant d'abord une incision au niveau du limbe dans la chambre antérieure à l'aide d'une lame de 15 ° (figure 1). Puis une lame incurvée de la cornée-sclérale ciseaux est inséré dans la chambre antérieure. Découpes circonférentielles sont faites dans la cornée, juste en avant du limbe.
2. 0,12 Colibri pinces et de ciseaux Westcott sont utilisés pour couper l'iris circonférentiellement antérieure du corps ciliaire.
3. Le noyau du cristallin est retiré avec une pince ou d'un Colibri 0,12 à 15 ° lame (supersharp) et le cortex et la capsule avec une pince.

2. Aspiration fondamentale vitré.

1. Une aiguille de calibre 23 sur une seringue de 5 cc est inséré dans le milieu du vitré (figure 1).
2. Environ 1 mL ou plus du noyau du vitré est doucement aspiré.
3. L'échantillon est ensuite placé dans un tube de centrifugeuse, puis dans l'azote liquide.

3. Dissection antérieure hyaloïde.

1. La hyaloïde antérieure est considéré comme un anneau semi-transparente en ajustant la lumière incidente à partir d'un microscope à lumière col de cygne. L'aspiration précédente du noyau vitreux sépare la hyaloïde antérieure auprès d'autres structures pour faciliter leur identification.
2. La feuille de tissu élastique est soigneusement arrachée du corps ciliaire avec Colibri ou pinces à pansement et coupé avec des ciseaux Vannas. Cette manoeuvre est répétée.
3. L'échantillon est ensuite placé dans un tube de centrifugeuse, puis dans l'azote liquide.

4. Dissection base du vitré.

1. Utiliser 0,12 pince pour stabiliser la coupe des yeux, des ciseaux Westcott sont utilisés pour «fleur» de l'œil en faisant quatre équidistants-stress coupes du corps ciliaire vers la tête du nerf optique.
2. Le plicata pars du corps ciliaire (figure 2) est retiré de chacun des quadrants en utilisant des ciseaux Westcott.
3. La base du vitré est ensuite saisie de chaque côté de l'ora serrata avec une pince sur la pars plana et de la rétine (figure 2).
4. Traction continue sur la base du vitré est appliqué avec la pince. De coupe avec des ciseaux séquentielle Westcott extraits un tissu semi-transparent avec un «collier de perles" apparence car elle est excisée.
5. L'échantillon est ensuite placé dans un tube de centrifugeuse, puis dans l'azote liquide.

5. Retrait cortex vitréen.

1. La pars plana est excisé de chacun des quadrants avec des ciseaux Westcott en coupant la notice d'environ 3 mm en arrière de l'ora serrata (figure 2).
2. Entre les feuillets de tissu, le cortex vitréen est visualisée comme un film semi-transparents.
3. Le film élastique est soit saisi avec une pince 0,12 ou détenus par l'adhésion à une éponge Weck-Cel chirurgicale. Le cortex vitréen est alors arrachée de la rétine et excisée avec des ciseaux Westcott (figure 1).
4. L'échantillon est placé dans un tube de centrifugeuse, puis dans l'azote liquide. Tous les échantillons sont stockés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation pour l'expérimentation.

6. Les résultats représentatifs

Des échantillons de tissus peuvent être traités par une variété de méthodes pour des expériences spécifiques. Dans notre cas, les échantillons ont été soumis à l'analyse des protéines par SDS-PAGE (figure 3).

Figure 1. Vue en coupe de l'œil humain dépeignant sous-structures différentes parties du corps vitré. Le vitré plus antérieure est une fine couche de collagène appelé la hyaloïde antérieure. Le noyau vitreux comprend toute la région centrale du corps vitré. Cette portion du corps vitré est plus aqueuse, contrairement à la base du vitré, ce qui est assez visqueux pour être saisi par des pinces et est fermement attaché au corps ciliaire et la rétine sous-jacente. Englobant le cœur vitré est une coquille très mince collagène appelé le cortex vitréen.

Figure 2. Anatomie base du vitré. La base du vitré est une sous-structure semi-transparente du corps vitré situé le long de l'ora serrata (flèches blanches), qui est la ligne de démarcation séparant le corps ciliaire et la rétine. Le bord antérieur de la base du vitré s'étend sur la pars plana (ligne blanche) du corps ciliaire. Le bord postérieur de la base du vitré s'étend 2-3-mm derrière l'ora serrata (tiret blanc). Pour accise la base du vitré, forceps sont utilisés pour saisir le tissu et tirez loin du corps ciliaire et la rétine sous-jacente. Une fois élevés, ciseaux Westcott sont utilisés pour couper le long de la base.

Figure 3. Unidimensionnelle SDS-PAGE des éléments du corps vitré. Concentrations de protéines totales de la hyaloïde antérieure, base du vitré, vitreous coeur, et cortex vitréen étaient 11,24, 20,1, 16,61, 14,24 mg / mL, respectivement. L'électrophorèse sur gel a été réalisée à 200 kV pendant 45 minutes, colorées avec Flamingo (Bio-Rad), et visualisées en utilisant un système d'imagerie VersaDoc (Bio-Rad). Les profils pour les différents tissus montrent plusieurs bandes similaires, indiquant soit conservée ou la contamination croisée des protéines, ainsi que des bandes uniques (astérisque), indiquant protéines différentiellement localisées.

Discussion

Le corps vitré est un gel semi-transparente, dont la composition moléculaire est mal comprise, en particulier au niveau de ses sous-structures: la base du vitré, le noyau, le cortex, et hyaloïde antérieure. Le noyau contient du vitré collagènes II, V, IX et XI, avec les protéoglycanes chondroïtine sulfate, héparane sulfate protéoglycanes, et hyaluronane ^1,2. Biomarqueurs protéiques dans le coeur du vitré ont été associés à des maladies telles que la rétinopathie diabétique. ^3-5 Comment ces protéines sont différentiellement exprimés dans chacune des sous-structures, et dans de nombreux cas l'identité des protéines spécifiques, ne sont pas connus. Ces détails peuvent donner un aperçu de l'origine des protéines associées à certaines maladies vitréo-rétinienne et d'aider les thérapies futures cibles. Bien que le poste d'intervalle optimal mortem pour la dissection des tissus n'a pas été déterminée, la dégradation des protéines peut affecter expériences en aval. Par exemple, l'immunohistochimie est affectée dans les yeux de l'autopsie de 12 heures et certaines activités enzymatiques spécifiques peuvent être réduits en quelques heures (observation non publiée). Tous les tissus dans cette étude ont été recueillies entre 2 et 8 heures de la mort, sans changements importants dans l'expression de protéines ou d'aptitude à analsyis protéomique. La méthode de congélation de l'azote liquide de conservation est choisi au cours de fixation afin d'éviter de petits changements dans la structure des protéines causée par fixateur réticulation, ce qui a été démontré dans d'autres tissus par LC-MS/MS. ⁶ études protéomiques dépendra de la capacité à bien disséquer les différents compartiments du corps vitré, comme l'a démontré dans cette expérience vidéo. Nous avons validé la technique de dissection avec une dimension SDS-PAGE. Comme nos résultats suggèrent, il ya des protéines différentiellement exprimés dans les sous-structures différentes du corps vitré. L'identification de ces protéines permettra une compréhension plus détaillée de cloisonnement vitré.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom	Société	Nombre de catalogue
0,12 pince	Storz Ophthalmics	E1502
5 cc seringue	Becton-Dickinson	309603
Droit pinces à pansement avec des dentelures	Storz Ophthalmics	E1400
Aiguille de calibre 23	Becton-Dickinson	305145
Colibri pince	Storz Ophthalmics	2 / 132
Castroviejo angle des ciseaux cornéens	Storz Ophthalmics	E3223
Vannas courbé ciseaux à capsulotomie	Storz Ophthalmics	E3387
Weck-Cel chirurgicale lances	Medtronic	0008680
Ciseaux Westcott ténotomie courbé	Storz Ophthalmics	E3320