אנו מספקים שיטה לבדיקת גרסאות BRCA1 ב assay רקמה תרבות המבוססת לתיקון הומולוגיים רקומבינציה של נזק לדנ"א על ידי depleting החלבון BRCA1 אנדוגני מתא באמצעות RNAi והחלפתו מוטציה נקודת BRCA1 המכיל לשנות קידוד.
ניתוח פונקציונלי של מוטציות missense יכול להיות מסובך ידי נוכחות בתא של חלבון אנדוגני. מבנה פונקציה ניתוח BRCA1 כבר מסובך מחוסר assay חזקים החלבון BRCA1 מלא אורך הקשיים הכרוכים בעבודה עם שורות תאים המבטאים חלבון BRCA1 hypomorphic 1,2,3,4,5. פיתחנו מערכת לפיה את החלבון BRCA1 אנדוגני בתא היה מדולדל בחריפות על ידי RNAi מיקוד 3'-UTR-mRNA BRCA1 ו הוחלף על ידי שיתוף transfecting פלסמיד המבטא גרסה BRCA1. אחד היתרונות של הליך זה היא כי ההשתקה חריפה של החלפת BRCA1 ו סימולטני לאפשר לתאים לגדול ללא מוטציות משני או התאמות שעלולות להתעורר לאורך זמן על מנת לפצות על אובדן של הפונקציה BRCA1. דלדול זה ולהוסיף גב ההליך נעשה קו הלה הנגזרות תא היה assayed בקלות לפעילות הומולוגיים רקומבינציה. Assay הומולוגיים רקומבינציה מבוסס על שיטה שפורסמו בעבר לפיה מצע רקומבינציה משולב לתוך הגנום (איור 1) 6,7,8,9. זה המצע רקומבינציה יש נדיר חיתוך I-SCEI אנזים הגבלה בתוך אתר אלל GFP פעיל, במורד הוא אלל second-GFP פעיל. Transfection של פלסמיד המבטא I-SCEI תוצאות לשבור פעמיים תקועים, אשר עשוי להיות מתוקן על ידי רקומבינציה הומולוגיים, ואם הומולוגיים רקומבינציה עושה לתקן את לשבור אותו יוצר אלל GFP פעיל כי הוא הבקיע בקלות ביטוי חלבון ה-GFP על ידי זרימת cytometry . דלדול של BRCA1 אנדוגני הביא לירידה של 8-10 פי בפעילות הומולוגיים רקומבינציה, ולהוסיף גב של הפונקציה רקומבינציה פלסמיד wild-type שוחזר במלואו הומולוגיים. כאשר נקודה מסוימת של מוטציות BRCA1 באורך מלא באו לידי ביטוי מתוך שיתוף transfected פלסמידים, ההשפעה של מוטציה missense ספציפי יכול להיות קלע. כדוגמה, את הביטוי של החלבון BRCA1 (M18T), סוג של משמעות קלינית ידוע 10, באה לידי ביטוי התאים האלה, היא לא הצליחה לשחזר BRCA1 תלויי הומולוגיים רקומבינציה. על ידי הביטוי לעומת זאת, גרסה של אחר, גם משמעות ידועה, BRCA1 (I21V) שוחזר במלואו BRCA1 תלויי הומולוגיים פונקציה רקומבינציה. אסטרטגיה זו של בדיקות תפקוד של מוטציות BRCA1 missense הוחל על מערכת ביולוגית אחרת assaying לתפקוד centrosome (קייס ואח', תצפיות לא פורסם). ככלל, גישה זו מתאימה לניתוח מוטציות בגן missense כל זה יש לנתח recessively.
היתרון של שיטה זו הוא כי אנו יכולים לחקור את הפונקציה של החלבון BRCA1 בוויסות תיקון DNA על ידי רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים בעלי wild-type BRCA1 הביע endogenously. אימצנו שתי שיטות הוקמה נפרדים של הלומדים בתהליך הומולוגיים רקומבינציה של ניצול RNAi בתיווך דלדול כדי להשיג את שיטה חדשה לבדיקת גרסאות BRCA1 עבור לתפקד תיקון דנ"א. המפתח להצלחה של שיטה זו היה להקים קו תא transfectable בקלות, כמו הלה, עם המצע רקומבינציה בגנום כך אנו מקבלים רמות גבוהות מאוד של ההמרה GFP. היו לנו מספר הוקרן שיבוטים של טרנספורמציה המקורי כדי להשיג אחד כי לא היה אות לגילוי GFP ברקע, אבל על transfection הביטוי I-SCEI הפלסמיד לו רמה גבוהה מאוד של ההמרה GFP.
באמצעות שיטה זו, אנו נמצאים כעת בחקירת אחרים ספציפיים חומצה אמינית BRCA1 שאריות עבור לתפקד רקומבינציה הומולוגיים. יחד עם תובנות ביולוגיות מעבודה זו, מסקנות אלה יכול להיות מיושם על גנטיקה וסרטן קליניים. אחוז גבוה של מוטציות BRCA1 missense יש משמעות קלינית ידוע מאז ישנם וריאנטים נדירים רבים, ואין מספיק מידע עבור רבים של אלה לקבוע את הקשר סרטן על ידי ניתוח הפרדה גנטית 3,10,13,14. באמצעות שיטה זו, התוצאות של גרסה מסוימת על התפקוד הביולוגי של BRCA1 בוויסות הומולוגיים רקומבינציה יכול לשמש כדי ליידע את הנשים לבצע אחת הגרסאות הללו בגנום שלהם.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים מרכז אוהיו מקיף אוניברסיטת סרטן למתן מימון עבור עבודה זו.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DMEM | Invitrogen | 11960 | ||
FBS | USA Scientific | 9871-5200 | ||
siRNA | Invitrogen | N/A | ||
Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | ||
TrypLE | Invitrogen | 12604 | ||
Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | ||
Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | ||
GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | ||
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |