इन विट्रो biofilm गठन में एक चैंबर 8 अच्छी तरह से स्लाइड में

Summary

यह लेख एक कक्ष 8 अच्छी तरह स्लाइड के भीतर हो एक जीवाणु biofilm गठन और दृश्य के लिए प्रक्रिया का वर्णन

Abstract

कई रोगों के जीर्ण प्रकृति बैक्टीरिया biofilms जो पारंपरिक एंटीबायोटिक उपचार के लिए अड़ियल हैं के गठन के लिए जिम्मेदार ठहराया है. Biofilms समुदाय जुड़े एक सतह से जुड़ी है और एक मैट्रिक्स में encased जीवाणु रहे हैं. बाह्य मैट्रिक्स की भूमिका बहुमुखी है, पोषक तत्वों की अधिग्रहण की सुविधा सहित, और पर्यावरण तनाव (जैसे मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया) के खिलाफ महत्वपूर्ण सुरक्षा प्रदान करता है. कैसे एक biofilm के भीतर बैक्टीरिया पर्यावरण तनाव हम एक प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है जिसमें हम बैक्टीरिया biofilms है जो एक कक्ष 8 अच्छी तरह से स्लाइड में का गठन किया है कल्पना का जवाब के रूप में एक बेहतर समझ हासिल करने के प्रयास में. biofilms लाइव / मृत दाग BacLight के साथ दाग थे और एक confocal खुर्दबीन का उपयोग करने के लिए ऊष्मायन शर्तों के अलग तहत रिश्तेदार biofilm, आकार और संरचना विशेषताएँ जांच. Z ढेर छवियों confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से एकत्र किए गए थे और COMSTAT से विश्लेषण किया है. इस प्रोटोकॉल मदद करने के लिए तंत्र और जिसके द्वारा biofilms रूप कैनेटीक्स, घटक है कि biofilm संरचना और स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण हैं की पहचान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

1. इन विट्रो biofilm गठन में बैक्टीरियल कालोनियों (जो उचित रात भर अगर पर विकसित किया गया है) मीडिया में निलंबित कर दिया गया और आयुध डिपो 490 0.65 के लिए समायोजित किया गया परिणामस्वरूप जीवाणु निलंबन तो 1:06 (1 एमएल बैक्टीरियल + निलंबन 5 एमएल पूर्व गर्म मध्यम) पतला था और 37 में incubated डिग्री सेल्सियस लगभग 3 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ मध्य क्रम में लॉग चरण तक पहुंचने के लिए. पूर्व गर्म मीडिया और जगह कमजोर पड़ने की μL 200 के साथ एक कक्ष 8 अच्छी तरह स्लाइड के प्रत्येक कुएं में मध्य लॉग विकास निलंबन 1:2500 पतला. 37 पर 5% के साथ डिग्री सेल्सियस सीओ 2 सेते हैं . के बाद लगभग 16 घंटे, प्रत्येक कक्ष के कोने से aspirate मध्यम और 200 μL ताजा, पूर्व गर्म मध्यम जोड़ – कक्ष की दीवार के साथ बांटना इतनी के रूप में चैम्बर के भीतर जो biofilm को बाधित कर सकता नहीं कतरनी बलों को बनाने के लिए. यदि 24 घंटे से अब incubating, हर 12 घंटे के माध्यम के रूप में बदलने के लिए या बैक्टीरियल व्यवहार्यता बनाए रखने की जरूरत है. 2. Biofilm के दृश्य प्रत्येक कक्ष से Aspirate मध्यम, के रूप में ऊपर वर्णित है, और निवासी biofilm बाँझ खारा के साथ दो बार धीरे से धो. एक अच्छी तरह से BacLight लाइव / मृत दाग (3 μL घटक ए + 3 खारा के एमएल प्रति μL घटक बी) के 200 μL जोड़ें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. इस बिंदु से आगे प्रकाश से संस्कृति को सुरक्षित रखें. दाग Aspirate और दो बार धीरे बाँझ नमक के साथ पहले के रूप में धो. तटस्थ के 200 μL जोड़ें एक अच्छी तरह से formalin buffered और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते नमूने को ठीक. लगानेवाला निकालें और ठीक संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार के निपटान. नमक के साथ दो बार धोने और धोने तरल पदार्थ है कि इसके बाद के संस्करण के रूप में formalin होते के निपटान. स्लाइड से प्लास्टिक कुओं निकालें, प्रत्येक के लिए पर्याप्त खारा जोड़ने के लिए अच्छी तरह से इतना है कि जब एक coverslip गैसकेट पर रखा गया है, कोई हवाई बुलबुले मौजूद हैं. Coverslip और बढ़ते मध्यम के साथ सील coverslip के किनारों. नेल पॉलिश के लिए स्लाइड्स को सील लेकिन स्लाइड्स स्थायी रूप में नहीं होगा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सीलेंट लगभग 1 घंटे के लिए शुष्क करने के लिए माइक्रोस्कोपी के माध्यम से जांच करने से पहले अनुमति दें. 3. परिणाम चित्रा 1 एक कक्ष 8 अच्छी तरह से स्लाइड में गठित biofilm के प्रतिनिधि 3D संमिश्र छवियों. जीवाणु लाइव / मृत दाग जिसमें जीवित बैक्टीरिया के साथ लेबल रहे थे प्रतिदीप्ति हरे और मृत बैक्टीरिया लाल प्रतिदीप्ति. (ए) पूरे टावरों और पानी चैनल के साथ विशिष्ट वास्तुकला दिखा biofilm के समग्र छवि. (बी) के समान biofilm (ए) के रूप में, अब पार अनुभाग में देखा.

Discussion

व्यवस्था है जिसके द्वारा biofilms फार्म के रूप में उनके मैट्रिक्स घटक निस्र्पक के रूप में अच्छी तरह से समझना गहन रुचि का एक क्षेत्र है. इस प्रोटोकॉल प्रोटीन या अन्य घटक है कि biofilm के संरचनात्मक अखंडता, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पहचान करने और प्रोटीन जो खुद को एक चिकित्सकीय आवेदन के लिए उधार दे सकता है को लक्षित करने में मदद करने के लिए योगदान की पहचान में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल में ऊष्मायन बार और dilutions nontypeable Haemophilus influenzae (NTHI) द्वारा इष्टतम biofilm गठन के लिए स्थापित किया गया है . कुछ प्रारंभिक काम करने के लिए अन्य बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए इन चरणों का अनुकूलन की जरूरत हो सकता है (यानी प्रारंभिक कमजोर पड़ने और ऊष्मायन मध्य लॉग चरण विकास प्राप्त करने की आवश्यकता समय ). कक्षों के प्रारंभिक बोने के लिए 1:2500 कमजोर पड़ने के लिए सुनिश्चित करें कि एक मजबूत biofilm चैम्बर स्लाइड के रूप में इस जीव से प्रेरित और ऊष्मायन बार कहा के भीतर विकसित होगा biofilm चैम्बर overgrowing और / या थकाऊ उपलब्ध पोषक तत्वों के बिना स्थापित किया गया था, . तदनुसार, प्रारंभिक कमजोर पड़ने और या ऊष्मायन बार अन्य बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए समायोजित किया जा आवश्यकता हो सकती है.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Chocolate II agar		Fisher	B21267X
8-well chamber slides		Fisher	12-656-18
BacLight Live/Dead bacterial viability kit		Fisher	NC9439023
BHI		Fisher	211059
Hemin		Sigma	H5533
β-NAD		Sigma	N7004
Permaslip mounting media		Fisher	NC9693613