Denna artikel beskriver förfarandet för bildandet och visualisering av en bakteriell biofilm odlas inom en 8-brunnars kammare bild
Den kroniska natur många sjukdomar beror på bildandet av bakteriella biofilmer som är motsträviga till traditionell antibiotikabehandling. Biofilmer är community-associerade bakterier knutna till en yta och inneslutet i en matris. Den roll som den extracellulära matrisen är mångfacetterad, bland annat underlätta näringsämnen förvärvet, och ger ett betydande skydd mot miljöpåfrestningar (t.ex. värd immunsvar). I ett försök att få en bättre förståelse om hur bakterier i en biofilm svara på miljöpåfrestningar har vi använt ett protokoll där vi visualiserar bakteriella biofilmer som har bildats i en 8-brunnars kammare bild. Den biofilmer färgades med BacLight Live / Dead fläcken och undersöks med hjälp av ett konfokalmikroskop att karaktärisera den relativa biofilmen storlek och struktur under varierande inkubation förhållanden. Z-stack bilder samlades in via konfokalmikroskopi och analyseras av COMSTAT. Detta protokoll kan användas för att hjälpa till att belysa den mekanism och kinetik genom vilka biofilmer form, samt identifiera komponenter som är viktiga för biofilm struktur och stabilitet.
Att förstå den mekanism genom vilken biofilm form, samt karaktäriserar deras matriskomponenterna, är ett område av stort intresse. Detta protokoll kan användas för att identifiera proteiner eller andra beståndsdelar som bidrar till den strukturella integriteten av biofilm, samt att identifiera och målproteiner som kan lämpa sig för ett terapeutiskt program.
Den inkubationstiderna och utspädning i ovan beskrivna protokollet har fastställts för optimal biofilm bildning av nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi). Vissa förarbeten kan behövas för att optimera dessa steg för andra bakteriearter (dvs. första utspädning och inkubationstiden behövs för att uppnå mitten log tillväxtfas). Den 1:2500 utspädning för det första sådd av kamrarna har inrättats för att säkerställa att en robust biofilm skulle utvecklas i kammaren bilderna som orsakas av denna organism och inom inkubationstiderna anges, utan att biofilmen igenväxning kammaren och / eller utmattande tillgängliga näringsämnen . Därför kan den initiala utspädning och eller inkubationstider behöva anpassas för andra bakteriearter.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet har finansierats av NIDCD / NIH R01DC003915 till LO Bakaletz.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Chocolate II agar | Fisher | B21267X | ||
8-well chamber slides | Fisher | 12-656-18 | ||
BacLight Live/Dead bacterial viability kit | Fisher | NC9439023 | ||
BHI | Fisher | 211059 | ||
Hemin | Sigma | H5533 | ||
β-NAD | Sigma | N7004 | ||
Permaslip mounting media | Fisher | NC9693613 |