هنا ، نحن تصف كيفية إنتاج ، وتوسيع ، وبعدها immunolabel الحصين الخلايا العصبية السلف (الشخصيات) في الثقافة (3D) ثلاثي الأبعاد. المقبل ، وذلك باستخدام تقنيات التصور الهجين ، علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام الصور الرقمية من cryosections immunolabelled لإعادة بناء ورسم خريطة للموقف المكاني للخلايا في جميع أنحاء immunopositive neurosphere 3D بأكمله.
أهمية الطوبوغرافيا (3D) 3 الابعاد في التأثير على الخلايا الجذعية العصبية والسلف (مجلس الشعب) هو النمط الظاهري على نطاق واسع حتى الآن اعترف تحديا للدراسة. عندما ينفصل عن المخ الجنينية أو بعد الولادة ، واحد الشخصيات تتكاثر في تعليق لتشكيل neurospheres. الخلايا الوليدة داخل هذه الثقافات اعتماد عفويا الأنساب تنموية متميزة (الخلايا العصبية ، oligodendrocytes ، والنجمية) على مدى التوسع على الرغم من أن تتعرض لنفس الوسط خارج الخلية. يلخص هذا التطور لاحظ العديد من المراحل على مدى تكوين الخلايا العصبية وgliogenesis في مرحلة ما بعد الولادة الدماغ وغالبا ما تستخدم لدراسة البيولوجيا الأساسية للمجلس الوطنى ضمن بيئة تسيطر عليها. تقييم الأثر الكامل للتضاريس 3D وتحديد المواقع الخلوية داخل هذه الثقافات على مصير مجلس الشعب ، على أية حال ، من الصعب. في توطين البروتينات المستهدفة وتحديد الأنساب مجلس الشعب التي كيمياء سيتولوجية مناعية ، يجب أن يكون مطلي التعويم الحر neurospheres على ركيزة مقطوع أو متسلسل. هذا أمر مطلوب لضمان تجهيز يعادل permeabilization الخلية وصول الأجسام المضادة في جميع أنحاء المجال. ونتيجة لذلك ، يمكن للصور epifluorescent 2D أو إعادة البناء من cryosections مبائر من مداخن 3D – Z سوى تقديم المعلومات المكانية عن موقف شرائح منفصلة داخل الخلية الجسدية أو 3D الرقمية ولا تصور الموقف الخلوية في المجال سليمة. هنا ، أن أؤكد مجددا على تضاريس الثقافة neurosphere والسماح التحليل المكاني للتعبير البروتين في جميع أنحاء ثقافة بأكملها ، نقدم بروتوكول للعزلة ، والتوسع ، وsectioning المسلسل في مرحلة ما بعد الولادة neurospheres الحصين مناسبة للمناعي epifluorescent مبائر أو البروتينات الهدف. ويتم تحليل Connexin29 (Cx29) كمثال على ذلك. المقبل ، وذلك باستخدام مزيج من تحرير الرسم والنمذجة 3D برامج التطبيق الصارم للحفاظ على التفاصيل البيولوجية ، ونحن تصف كيفية إعادة تجميع المواقع 3D الهيكلية لهذه الصور والخرائط رقميا الخلايا المسمى داخل neurosphere كاملة. هذه المنهجية يمكن تصور وتحليل للموقف من البروتينات الخلوية والخلايا المستهدفة في جميع أنحاء 3D التضاريس ثقافة بأكملها ، وسوف يسهل تحليل أكثر تفصيلا للالعلاقات المكانية بين الخلايا على مدى تكوين الخلايا العصبية وgliogenesis في المختبر.
وساهم كل من Imbeault فالنزويلا على قدم المساواة وينبغي النظر في الكتاب المشترك الأول.
يصف هذا البروتوكول إجراء للثقافة ومتسلسل cryosection بعد الولادة الشخصيات الحصين وتوطين التعبير بواسطة بروتين مناعي ، وأخيرا إعادة بناء وتحليل الموقف الطوبوغرافية للخلايا داخل immunopositive neurosphere في 3D بأكمله. عن طريق الجمع بين الخلية والبيولوجيا ثقافة تقنيات المعالجة ، والتصوير المجهري (OpenLab ، الإرتجال وغيرها من برامج تحليل الصور) ، أو رسم برامج تحرير قدرات (أدوبي فوتوشوب) ، والرسوم المتحركة وقدرات 3D compositing البرمجيات (أوتوديسك مايا) ، ونحن تقديم منهجية لإعادة بناء الخليوي تكوين الثقافات كلها من الصور 3D 2D المسلسل السماح لاعادة اعمار لموقف المؤمنين الخلوية وبروتين تعبير في جميع أنحاء ثقافة neurosphere. ويمكن الجمع بين هذا البروتوكول مع فعالية مساوية للتسجيل وإعادة بناء أجزاء المسلسل epifluorescent رقيقة أو مبائر مداخن Z – سمكا من خلال المقاطع التسلسلي. لأن التوسع النسيلي من الشخصيات واحد في الثقافة neurosphere يلخص العديد من مراحل لوحظ على مدى تكوين الخلايا العصبية وgliogenesis في مرحلة ما بعد الولادة في الدماغ ، وتأثير هيكلها 3D يمثل مصير مجلس الشعب محددا هاما في ذرية يتعرضون لنفس الوسط التجريبية 1. الاختلاف في نسب البروتين والتعبير في القلب والمحيط الخارجي للأقسام neurosphere المسلسل يوحي بأن العوامل المادية متعددة بما في ذلك موقف الخلية ، والإجهاد الميكانيكية ، وقوة القص تلعب أدوارا هامة في تنظيم المجلس الوطنى البيولوجيا 2. علاوة على ذلك ، وقد تبين connexin تعبير البروتين ، وتحليلها هنا ، لتغيير تبعا عند المثقف والشخصيات neurospheres 3D في تعليق أو مطلية على ركيزة laminin الاتصالات مع connexin بوساطة تغيير وظيفي سواء مثقف الخلايا على البلاستيك وركيزة أو في 3D مجانا العائمة الثقافات 3. أثر موقف الخليوي في مصير المجلس الوطنى لا يزال غير واضح. فمن الصعب فنيا لتحليل تأثير الموقع المكاني داخل الثقافة 3D على الأحياء نظرا إلى أن المجلس الوطنى لتقييم مستضدي الانساب والبروتينات يتطلب إشارات اختلال البنية 3D لتمكين permeabilization الخلية والوصول إلى جميع خلايا الجسم المضاد. هنا ، وتبين لنا أن منهجية التصور الهجين يوفر وسيلة لتحديد ما إذا كان يحمل بروتينات معينة تعريب الموضعية فريدة من نوعها في الثقافة 3D ، يمكن استخدامها لاستنتاج واختبار وظيفة البروتين والتنظيم فيما يتعلق توطين الإقليمية داخل neurosphere ، وربما الأهم من ذلك ويوفر البيانات اللازمة لالموضعية دراسة تأثير التضاريس وتحديد المواقع 3D الخليوي في مجلس الشعب في مصير الثقافة 3D.
The authors have nothing to disclose.
نشكر ايفان دسرت] ومارك ليونارد للحصول على المساعدة من الخبراء التقنيين في مجال إنتاج الفيديو وتحريرها ، ومات كوك للحصول على المساعدة في جمع البيانات ، وسارة Gelbard للمساعدة التحرير الخبراء. وقد تم تمويل العمل من المنح التي تعمل من المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR ، MOP 62626) لSALB ، وهي مبادرة للتدريب في مجال البحوث الاستراتيجية الصحية لبرنامج المنح وSALB SF (CIHR برنامج التدريب في Lipidomics الاعصاب ، TGF 9121) ، والبنية التحتية بدعم من مؤسسة الابتكار وأونتاريو الكندية الاستئماني الابتكار لسادس. تلقت منحة دراسية عليا SI أونتاريو في مجال العلوم والتكنولوجيا بمساهمات من اتحاد البحوث باركنسون. NV يتلقى معهد الشيخوخة وCIHR برنامج التدريب في Lipidomics الاعصاب بعد الزمالة المهنية. نحن نعترف بامتنان دعم البرامج التعليمية والتقنية التي تقدمها أبحاث أوتوديسك.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Euthansol | Reagent | Schering-Plough Canada Inc. | ||
Krazy Glue | Reagent | Home Hardware | ||
VT1000S vibratome | Equipment | Leica Microsystems | ||
Neural protease | Reagent | Sigma | P6141 | Stock solutions stored at -20°C |
Papain | Reagent | Sigma | P4762 | Stock solutions stored at -20°C |
DNAse I | Reagent | Roche | 11 284 932 001 | Stock solutions stored at -20°C |
MZ6 Dissecting Microscope | Equipment | Leica Microsytems | ||
ProBlot 6 Hybridization Oven | Equipment | Labnet via Mandel Scientific | ||
Centrifuge 5702 | Equipment | Eppendorf | ||
kPBS | Reagent | BioShop | PBS404 | |
B27 Supplement | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
Ultra Low Binding Tissue Culture Dishes | Disposable | Corning | 3261 | |
Human Epidermal growth Factor | Reagent | Invitrogen | 13247-051 | Stock solutions stored at -20°C |
Fibroblast growth factor-2 | Reagent | Invitrogen | 13256-029 | Also known as basic fibroblast growth factor (bFGF) Stock solutions stored at -20°C |
37% formaldehyde (molecular grade) | Reagent | Sigma | F8775 | |
Belly Dancer Shaker | Equipment | Stovall | ||
Tissue- Tek Cryomold | Disposable | Sakura | 4566 | |
Tissue-Tek OCT compound | Reagent | Sakura | 4583 | |
Whatman Grade 703 Blotting Paper | Disposable | VWR | 28298-020 | |
CM1900 Cryostat | Equipment | Leica | ||
Polyclonal Anti-Cx29 Primary Antibody | Reagent | Kindly provided by Dr David Paul, Harvard Medical School | Stored 1:1 in glycerol at -20°C | |
Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | Stored 1:1 in glycerol at -20°C | |
Hoechst 33258 | Reagent | Sigma | 861405 | |
DMRA2 epiflourescent microscope, Orca ER camera, OpenLab v3.56 | Equipment/ Software | Leica Hamamatsu Improvision/Perkin Elmer | This protocol can be performed with any epifluorescent or confocal microscope. | |
Photoshop CS4 | Software | Adobe | Graphic software | |
Maya v10 | Software | Autodesk | Modeling software | |
Computer | Equipment | Processor: Intel Corei7 920 Memory: 12GB DDR3 Video card: Nvidia GTX 285 (1GB RAM) |
Modeling hardware |
* All other standard chemical reagents listed in the protocol are from Sigma-Aldrich. All other standard tissue culture reagents are from Invitrogen.