Méthode d'insertion de levure Colony
Summary
Une méthode pour l'intégration des colonies de levures permettant la coupe pour la microscopie optique et électronique. Ce protocole permet la détermination de la distribution de cellules et les cellules sporulées pseudohyphal au sein des colonies fournissant un nouvel outil pour comprendre l'organisation de types de cellules dans une communauté fongiques.
Abstract
Modélisation des différents types de cellules dans des embryons est un mécanisme clé dans le développement des métazoaires. Communautés de microorganismes, comme les colonies et les biofilms également afficher les modèles de types cellulaires. Par exemple, dans la levure S. cerevisiae, les cellules et les cellules sporulées pseudohyphal ne sont pas réparties uniformément dans les colonies. L'importance fonctionnelle de la structuration et les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces tendances sont encore mal compris.
Un défi à l'égard de schémas de enquêter types de cellules dans les colonies fongiques, c'est que contrairement au tissu métazoaires, les cellules en colonies sont relativement faiblement attaché à un autre. En particulier, colonies de champignons ne contiennent pas le même niveau complète de la matrice extracellulaire dans la plupart des tissus. Nous rapportons ici une méthode pour intégrer et de sectionnement des colonies de levures qui révèle les habitudes intérieures de types de cellules dans ces colonies. La méthode peut être utilisée pour préparer des coupes épaisses (0,5 μ) utiles pour la microscopie optique et lames minces (0,1 μ) adapté à la microscopie électronique à transmission. Cellules asques et pseudohyphal peuvent être facilement distingués des cellules de levure ovoïde par microscopie optique, tandis que la structure intérieure de ces cellules peuvent être visualisées par EM.
La méthode est basée sur les colonies environnantes avec de l'agar, les infiltrer avec des moyennes de Spurr, puis sectionner. Colonies avec un diamètre de l'ordre de 1-2 mm sont adaptés à ce protocole. En plus de visualiser l'intérieur des colonies, la méthode permet la visualisation de la région de la colonie qui envahit la gélose sous-jacente.
Protocol
Discussion
La méthode présentée révèle les structures internes des colonies. Parce que la méthode est efficace pour déterminer les schémas de types de cellule dans une plage de S. souches cerevisiae avec des morphologies différentes colonies, et aussi dans une espèce apparentée S. paradoxus 5, la méthode est également susceptible de travailler sur un large éventail de champignons et autres micro-organismes.
Une étape cruciale pour le succès de la méthode es…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche a été financée par le NIH 1R15GM094770.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | ||
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | ||
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 | |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 | |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA | |
| 2-Dimethyl aminoethanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE | |
| Mounting media | KPL | 71-00-16 | ||
| Rotating wheel | Ted Pella | Pelco 1055 | ||
| Microtome | Leica | Ultracut S |
References
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response. Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).
- Palkova, Z., Vachova, L. Life within a community: benefit to yeast long-term survival. FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).
- Shapiro, J., Vachova, L. The significances of bacterial colony patterns. Bioessays. 17, 597-597 (1995).
- Shapiro, J., Vachova, L. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).
- Engelberg, D. Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).
- Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization. J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).
- Piccirillo, S. The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies. Génétique. 184, 707-707 (2010).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).
- Piccirillo, S., Honigberg, S. M. Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies. Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).
- Vachova, L. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environ Microbiol. , (2009).
