En analytisk verktygslåda för omfattande biokemiska, struktur-och transkriptom Utvärdering av Oral Biofilmer medieras av mutans streptokocker
Summary
Biofilmer som bildas på tandytan är mycket komplexa och utsätts för ständiga medfödda och exogena miljöutmaningar, som modulerar sin arkitektur, fysiologi och transkriptom. Vi utvecklade en verktygslåda för att undersöka sammansättning, strukturella organisation och genuttryck av oral biofilm, som kan anpassas till andra delar av biofilm forskning.
Abstract
Biofilmer är mycket dynamiska, organiserat och strukturerat samhällen av mikrobiella celler insnärjd i ett extracellulärt matrix av varierande densitet och sammansättning 1, 2. I allmänhet biofilmer utveckla från mikrobiell kvarstad på en yta följt av bildandet av cellens kluster (eller microcolonies) och ytterligare utveckling och stabilisering av microcolonies, som förekommer i en komplex extracellulärt matrix. Majoriteten av biofilm matriser hamnen exopolysaccharides (EPS), och dentala biofilmer är inget undantag, speciellt de som förknippas med karies sjukdom, som oftast förmedlas av mutans streptokocker 3. EPS syntetiseras av mikroorganismer (S. mutans, en viktig bidragsgivare) med hjälp av extracellulära enzymer, såsom glucosyltransferases använda sackaros i första hand som underlag 3.
Studier av biofilmer som bildas på tandytan är särskilt utmanande på grund av deras ständiga exponering för miljömässiga utmaningarna i samband med komplexa kost-host-mikrobiella interaktioner som sker i munhålan. Bättre förståelse av de dynamiska förändringar av den strukturella organisationen och sammansättningen av matrisen, fysiologi och transkriptom / Proteome profil av biofilm-celler som svar på dessa komplexa samspel skulle ytterligare flytta fram kunskapen om hur orala biofilmer modulera patogenicitet. Därför har vi utvecklat ett analysverktyg-box för att underlätta biofilm analys på strukturell, biokemisk och molekylär nivå genom att kombinera vanliga och nya tekniker med skräddarsydd programvara för dataanalys. Standard analytiska (kolorimetriska tester, RT-qPCR och microarrays) och nya fluorescens tekniker (för samtidig märkning av bakterier och EPS) var integrerade med särskild programvara för dataanalys för att hantera komplicerade muntliga biofilm forskning.
Den verktygslåda består av fyra separata men sammanhängande steg (Figur 1): 1) biologiska testsystem, 2) Rå inmatning av data, 3) Data Processing, och 4) analys av data. Vi använde våra in vitro biofilmen modell och speciella experimentella förhållanden för att demonstrera användbarheten och flexibiliteten i verktygslåda. Biofilmen Modellen är enkel, reproducerbar och flera replikat av ett enda experiment kan göras samtidigt 4, 5. Dessutom ger det tidsmässiga utvärdering, införande av olika mikroorganismer 5 och bedömning av effekterna av olika experimentella betingelser (t.ex. behandlingar 6, jämförelse av mutanter vs moderstammen 5, kolhydrater tillgången 7). Här beskriver vi två specifika delar i verktygslåda, inklusive (i) ny programvara för microarray data mining / organisation (MDV) och fluorescens bildanalys (DUOSTAT), och (ii) in situ EPS-märkning. Vi erbjuder också en experimentell fall som visar hur verktygslåda kan hjälpa till med biofilmer analys, data organisation, integration och tolkning.
Protocol
Discussion
I denna presentation visade vi två kritiska komponenter i analytisk verktygslåda (EPS / bakterier bildbehandling och microarray data mining / bearbetning), mångsidighet och användbarhet av de olika analyser integrerade i systemet. Det är tydligt att verktygslåda underlättat den omfattande (jämförande) och samtidig analys av de olika aspekterna av biofilmer biokemi, arkitektur och genuttryck som svar på olika experimentella förhållanden med hjälp av en in vitro modell. 7 Med tanke på den…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Gary Xie och Herbert Lee för utveckling av MDV. Vi vill också tacka Dr. Simone Duarte, Ramiro Murata, Jae-Gyu Jeon, Jacqueline Abranches, och Ms Stacy Gregoire för sina tekniska och vetenskapliga bidrag till den analytiska delarna av verktygslåda. Denna studie har delvis stöd i USPHS Forskningsanslag DE018023 från National Institute of Dental och Kraniofaciala forskning.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Syto 9 | Invitrogen | S34854 | ||
| Syto 60 | Invitrogen | S11342 | ||
| Dextran conjugated alexa 647 | Invitrogen | D22914 | ||
| Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope | Olympus, Tokyo, Japan |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Leme, P. a. e. s., Koo, A. F., Bellato, H., Bedi, C. M., G, J. A. C. u. r. y. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation–new insight. J Dent Res. 85, 878-887 (2006).
- Koo, H., Schobel, B. D., Scott-Annem, K., Watson, G., Bowen, W. H., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K. Apigenin and tt-farnesol with fluoride effects on S. mutans biofilms and dental caries. J Dent Res. 84, 1016-1020 (2005).
- Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. J Bacteriol. 192, 3024-3032 (2010).
- Jeon, J. G., Klein, M. I., Xiao, J., Gregoire, S., Rosalen, P. L., Koo, H. Influences of naturally occurring agents in combination with fluoride on gene expression and structural organization of Streptococcus mutans in biofilms. BMC Microbiol. 9, 228-228 (2009).
- Klein, M. I., DeBaz, L., Agidi, S., Lee, H., Xie, G., Lin, A. H. M., Hamaker, B. R., Lemos, J. A., Koo, H. Dynamics of Streptococcus mutans transcriptome in response to starch and sucrose during biofilm development. PLoS ONE. , 0013478-0013478 (2010).
- Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to Study the Physiology of Oral Biofilms. Methods Mol Biol. 666, 87-102 (2010).
- Koo, H., Hayacibara, M. F., Schobel, B. D., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K., Vacca-Smith, A. M., Bowen, W. H. Inhibition of Streptococcus mutans biofilm accumulation and polysaccharide production by apigenin and tt-farnesol. J Antimicrob Chemother. 52, 782-789 (2003).
- Koo, H., Seils, J., Abranches, J., Burne, R. A., Bowen, W. H., Quivey, R. G. Influence of apigenin on gtf gene expression in Streptococcus mutans UA159. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 542-546 (2006).
- Klein, M. I., Duarte, S., Xiao, J., Mitra, S., Foster, T. H., Koo, H. Structural and molecular basis of the role of starch and sucrose in Streptococcus mutans biofilm development. Appl Environ Microbiol. 75, 837-841 (2009).
- Cury, J. A., Koo, H. Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms. Anal Biochem. 365, 208-214 (2007).
- Xiao, J., Koo, H. Structural organization and dynamics of exopolysaccharide matrix and microcolonies formation by Streptococcus mutans in biofilms. J Appl Microbiol. 108, 2103-2113 (2010).
- Thurnheer, T., Gmür, R., Shapiro, S., Guggenheim, B. Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque. Appl Environ Microbiol. 69, 1702-1709 (2003).
- Chalmers, N. I., Palmer, R. J. J. r., Du-Thumm, L., Sullivan, R., Shi, W., Kolenbrander, P. E. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl Environ Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Deng, D. M., Hoogenkamp, M. A., Ten Cate, J. M. >., Crielaard, W. Novel metabolic activity indicator in Streptococcus mutans biofilms. J Microbiol Methods. 77, 67-71 (2009).
