Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי
Summary
בסרטון הזה אנחנו מדגימים להדמיה טרנסלוקציה של PKC בתאים חיים באמצעות PKCS מתויג fluorescently.
Abstract
חלבון קינאז Cs (PKCS) הם סרין קינאזות תראונין כי תפקיד מרכזי בוויסות מגוון רחב של תהליכים תאיים כגון צמיחת תאים למידה וזיכרון. ישנן ארבע משפחות הידועים של isoforms PKC בבעלי חוליות: PKCS קלאסית (α, βI, βII ו γ), סוג הרומן אני PKCS (ε ו η), רומן מסוג II PKCS (δ ו θ), ו PKCS טיפוסיות (ζ ו ι ). PKCS קלאסית מופעלים על ידי Ca 2 + ו diacylclycerol (דאג), בעוד PKCS רומן מופעלים על ידי DAG, אבל הם Ca 2 + עצמאית. PKCS טיפוסיות מופעלים על ידי לא Ca 2 + וגם לא דאג. ב Aplysia californica, מערכת המודל שלנו ללמוד היווצרות הזיכרון, ישנם שלושה ספציפיים מערכת העצבים isoforms PKC אחד מתוך כל שיעור גדול, כלומר קונבנציונלי PKC Apl אני, סוג הרומן אני PKC Apl השנייה טיפוסיות PKC Apl III. PKCS הם שומנים בדם מופעל קינאזות ובכך ההפעלה של PKCS קלאסית רומן בתגובה לאותות תאיים כבר בקורלציה לעתים קרובות עם טרנסלוקציה PKC מן הציטופלסמה אל קרום התא. לכן, טרנסלוקציה PKC חזותי בזמן אמת בתאים חיים הפך להיות כלי רב ערך עבור הבהרת הולכת אותות מסלולים שיובילו הפעלת PKC. לדוגמה, טכניקה זו אפשרה לנו לקבוע כי isoforms שונים של PKC translocate בתנאים שונים לתווך סוגים שונים של הפלסטיות הסינפטית וכי (5HT) סרוטונין הפעלת PKC Apl השנייה דורשת ייצור של שני DAG ו phosphatidic חומצה (רש"פ) עבור טרנסלוקציה 1-2. חשוב לציין, את היכולת לדמיין את אותו הדבר שוב ושוב נוירון אפשרה לנו, למשל, כדי למדוד את הפחתת רגישות התגובה PKC בפירוט מעולה 3. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את כל שלב הכנת Sf9 תרביות תאים, תרביות של נוירונים Aplysia חושית תוארו במאמר אחר וידאו 4, להביע PKCS מתויג fluorescently ב Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי לחיות הדמיה טרנסלוקציה של PKC בתגובה activators שונים באמצעות לייזר מיקרוסקופיית.
Protocol
Discussion
תיארנו טכניקה הדימוי של טרנסלוקציה PKCS מתויג fluorescently בזמן אמת Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושית. Sf9 תאים לספק מערכת פשוטה טרנסלוקציה תמונה PKC מאז culturing ו transfecting אותם הוא די ישר קדימה. לעומת זאת, microinjection של נוירונים Aplysia חושית לוקח קצת זמן כדי לשלוט; עד כמה חודשים. קשיי…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקנדי הלאומי לבריאות מחקר (CIHR) מענק ויין ס Sossin. קרול א פרח הוא מקבל המלגה הבתר מן Fonds de la משוכלל ונדיר en סנטה קוויבק (FRSQ) וכן הרינגטון קונרד המילגה. המחברים מבקשים להודות ג'ואנה פתילון, מרגרט הייסטינגס מרגרט Labban לעזרה עם לירות וידאו בריכת מדליין ריצ'מונד לעזרה עם סקירה הגרפיקה.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | Gibco | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | Mattek | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments | TW100F-4 | Use to make microelectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Microelectrode holder | Tool | World Precision Instruments | MPH6S | Use to hold microelectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter | MP-85 | Use to position microelectrode in the three-axis |
References
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
