Live-avbildning av PKC translokation hos Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner
Summary
I denna video visar vi visualisering av PKC translokationen i levande celler med fluorescerande taggade PKCS.
Abstract
Proteinkinas Cs (PKCS) är serine treonin-kinaser som spelar en central roll i regleringen av en mängd olika cellulära processer såsom celltillväxt och inlärning och minne. Det finns fyra kända familjer av PKC isoformer hos ryggradsdjur: klassiska PKCS (α, βI, βII och γ), ny typ jag PKCS (ε och η), ny typ II PKCS (δ och θ) och atypiska PKCS (ζ och ι ). De klassiska PKCS aktiveras av Ca 2 + och diacylclycerol (DAG), medan romanen PKCS aktiveras av Dag, men är Ca2 +-oberoende. De atypiska PKCS aktiveras av varken Ca 2 + eller DAG. I Aplysia californica, vår modell för att studera minnet bildas, finns det tre nervsystemet specifik PKC isoformer en från varje större klass, nämligen den konventionella PKC APL jag, romanen typ I PKC APL II och atypiska PKC APL III. PKCS är lipid-aktiverade kinaser och därmed aktivering av klassiska och nya PKCS som svar på extracellulära signaler har ofta korrelerad med PKC translokation från cytoplasman till plasmamembranet. Därför har visualisera PKC translokation i realtid i levande celler blir ett ovärderligt verktyg för att belysa signaltransduktionsvägar som leder till PKC aktivering. Till exempel har denna teknik möjlighet för oss att konstatera att olika isoformer av PKC translocate under olika förhållanden för att förmedla olika typer av synaptisk plasticitet och att serotonin (5HT) aktivering av PKC APL II krävs produktion av både Dag och fosfatinsyra (PA) för translokation 1-2. Viktigt är förmågan att visualisera samma neuron upprepade gånger har gjort att vi, till exempel för att mäta hyposensibilisering av PKC svar i utsökt detalj 3. I den här videon visar vi varje steg för att förbereda Sf9 cellkulturer har kultur Aplysia sensoriska neuroner har beskrivits i en annan video artikel 4, uttrycka fluorescerande taggade PKCS i Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner och live-avbildning av PKC translokationen som svar på olika aktivatorer med hjälp av laser-scanning mikroskopi.
Protocol
Discussion
Vi har beskrivit en teknik för att bilden förflyttning av fluorescerande taggade PKCS i realtid i Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner. Sf9 celler ger ett enkelt system för att bilden PKC translokation sedan odling och transfecting dem är ganska enkel. Däremot tar mikroinjektion av Aplysia sensoriska neuroner lite tid att bemästra, upp till några månader. Svårigheter i samband med denna teknik inkluderar elektrod igensättning. Filtrering injektionslösningen och centrifugering det oft…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR) Bidrag till Wayne S. Sossin. Carole A. Farah är mottagare av ett postdoktorsstipendium från Fonds de la recherche en Santé du Québec (FRSQ) och en Conrad Harrington gemenskap. Författarna vill tacka Joanna Bougie, Margaret Hastings och Margaret Labban för hjälp med video skjuta och Madeline Richmond Pool för hjälp med grafisk översikt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | Gibco | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | Mattek | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments | TW100F-4 | Use to make microelectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Microelectrode holder | Tool | World Precision Instruments | MPH6S | Use to hold microelectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter | MP-85 | Use to position microelectrode in the three-axis |
References
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
