Allmänna anmärkningar: All verksamhet ska ske under en upprätt dissekera mikroskop (Olympus, SZX10 med Z-Axis Crank-post STU2 StandBoom Stand) och med hjälp av ett kirurgiskt coagulator. Ventilationen är avgörande för förfarandet och därför en viss tid bör läggas på valet av respirator och optimera ventilationen tekniken. Temperatur, blodtryck och anestesi ska vara stabil under hela. 1. Anestesi, Intubation och övervakning Använd C57BL / 6 möss som är minst 10 veckor gammal. Inducera anestesi med natrium pentobarbital vid en dos 70 mg / kg kroppsvikt ip upprätthålla anestesi med ca 10 mg / kg / h natrium pentobarbital. Var försiktig med att överdosera eftersom detta påtagligt kan sänka blodtrycket. Re-dosering av pentobarbital – även efter timmar-kan leda till allvarliga ökningar i plasmanivåerna. Baserat på starka belägg för isofluran som hjärtskyddande egenskaper rekommenderar vi användning av "inert" och väletablerade pentobarbital i en modell för myokardischemi 46-56. Placera möss på en temperatur-kontrollerad uppvärmd tabellen (RT, Effenberg, München, Tyskland) med en rektal termometer sond fäst termisk återföring controller för att upprätthålla kroppstemperaturen vid 37 ° C. Efter anestesi induktion säkra möss i ryggläge, med övre och nedre extremiteterna knutna till bordet med hjälp av en tejp och en sutur fäst till anklarna. Gör samma sak för huvudet med hjälp av tänderna. En tillräcklig besöksförbud är viktigt för en lyckad intubering och välkontrollerade kirurgi. Före operation, täck musen med mineralolja för att minska risken för musen hår allergi. Exponera luftstrupen kirurgiskt och utföra en endotrakeal intubering med hjälp av bluntpolyethylene kanyler (Insyte 22g, Beckton Dickinson, USA). Du måste trubbiga nålen för att kunna använda den som en stylet. Dra ut tungan med hjälp av en pincett och sedan tryck försiktigt i en 15-graders vinkel mot kroppen. Även efter exponering av luftstrupe och med hjälp av mikroskop kan detta kräver lite träning. Var medveten om att en liten skada på luftstrupen kan leda till en oförmåga att ventilera djuret hela suturen. Således, om du stöter på luftvägarna problem kontrollera luftstrupen för små hål. Bekräfta rätt rör placering genom direkt visualisering av kanylen inom de tidigare exponerade luftstrupen ovanför Carina. Anslut röret till en respirator. Vi rekommenderar en tryckstyrd ventilation teknik med hjälp av en Servo 900 C från Siemens (DRE veterinär, USA). Djuren kommer då att ventileras med hjälp av topp inspiratoriska tryck på 10 mbar, frekvens 110 andetag / min och ett positivt slut expiratoriskt tryck av 3-5 mbar med en FiO 2 = 0,4. Inställningar kan behöva vissa justeringar som kan uppnås lättast genom att kryssa i lungorna under öppen thoraxkirurgi. Se till att lungorna inte kollapsat eller överansträngda. Trots det faktum att Servo 900 C är byggd som fläkt för människor, arbetar dess användning i en tryckstyrd respirator inställning utmärkt för ventilation av möss. Utför analys blodgas att bekräfta normala gasutbytet (partialtryck av syre, PaO 2 av 115 ± 15 mmHg och partialtrycket av koldioxid, Paco 2 av 38 ± 6 mm Hg) efter 4 till 6 timmars ventilation tid med hjälp av i-STAT System (Abbott, USA). Pulsmätare med ett EKG (t.ex. Hewlett Packard, Böblingen, Tyskland). Se till att pulsen inte sjunker under 450. Om musen utvecklar bradicardia kontrollera temperaturen och narkos dos / koncentration. Xylacin / Ketamin anestesi framkallar ett hjärta mitt i 250 / min och rekommenderas därför inte. Applicera en lämplig vätskeersättning. En infusion med fysiologisk koksaltlösning 0,1 ml / timme via en arteriell eller venkateter bör utföras före uppkomsten av ischemi. Dessutom kan en saltlösning bolusdos på 500 l ges ip före operation. Thoractomy kan inducera ett blodtrycksfall och kan kräva ytterligare saltlösning Boli. Efter ischemi kan en infusionshastighet upp till 1 ml / timme vara nödvändigt för att upprätthålla ett medelvärde blodtryck över 60 mmHg och för att garantera en tillräcklig reperfusion avgörande för infarkt färgning med hjälp av TTC. Placera en halsartären (PE10, Tips OD (mm / "), koniska> 0,024 mm/.011") för kontinuerlig registrering av blodtryck. Halspulsådern kommer att exponeras genom dissektion av paratracheal muskler. Efter ytterligare exponering och noggrann undvikande av vävnad trauma (särskilt vagusnerven) är en kateter sätts in i fartyget med hjälp av två suturer och en liten klämma. Fäst armen mot kroppen innan du börjar dissekera artären. Detta kommer att utsätta en längre bit av artären. Knut Alldeles i slutet av den proximala delen av halspulsådern. Bifoga en större klämma till slutet av sutur för attatt få spänning. Ställ ytterligare ett sutur runt artär och dissekera artären till den mycket distala änden. Här, placera en liten klämma. Använd mikro sax för att klippa en liten diagonal öppning in i artären. Håll öppningen med en fin pincett (Dumont, WPI) och avancera rätt storlek katetern med händerna / pincett. Gör en knut med din andra sutur och säkra artären. Lossa klämman och avancera katetern ytterligare. Säkra katetern med flera knutar och tejp. 2. Teknik för koronar Ocklusion Dissekera huden och exponera den vänstra bröstkorgen väggen med en dissektion teknik. Skär muskler pectorals stora och minderåriga att exponera bröstkorgen väggen med en diatermi. Genom att dra i pectoralis major, droppar lungan och därmed en pincett från elektrokirurgisk enhet kan infogas, och 1-3 mm ovanför lunga, en horisontell linje som korsar sliter bör koagulerat. Genom att använda en trubbig sax, klipp bröstkorgen väggen. Ändrad säkerhetsnålar, där fångsten plattan tas bort och den trubbiga änden är böjd, används sedan för att hålla bröstkorgen öppen. För att underlätta den slutliga placeringen av suturer och koagulera och skära bröstkorgen väggen längs membranet mot den nedre vänstra sidan av bröstkorgen. Exponera hjärtat genom att dissekera hjärtsäcken. För att undvika diafragma rörelser bort och kapa phrenic nerv. Använd en liten våt bomull stick med en tång och vrid hjärtat åt höger sida. Identifiera vänster kranskärl (LCA) och se till att lungorna inte är alltför uppblåsta. Optimera öppnandet av bröstkorgen att ha ett säkert grepp i hjärtat när du placerar sutur. Om blodtrycket är för lågt identifieringen kan vara komplicerat. Ytterligare Boli av saltvatten kan förbättra identifiering av LCA. LCA är en klarröd fartyg korsar hjärtat horisontellt (i motsats till de återkommande vener). Ibland är LCA ses bäst utan ett mikroskop. Använd inte för mycket ljus. Detta kan leda till allvarlig reflektioner gör visualisering omöjligt. När LCA är visuellt identifieras, placera en 8,0 nylon suturer (Prolene, Ethicon, Notiefies, USA) runt LCA. För intermittent LCA ocklusion antog vi en kronisk modell av kardiomyopati 42 med hjälp av en hängande viktsystem. Trä sutur genom en liten bit plaströr (PE-10 rör) med trubbiga kanter och fäst två små vikter (1g, t.ex. användning Eppendorf rör fyllda med vatten) i varje ände. Med vikter fritt hängande över en stång bör LCA omedelbart blockerad. Dessutom, när vikten är lättad, är LCA ocklusion avslutas på en gång. Framgångsrika LCA ocklusion bör bekräftas med en omedelbar färgförändring av fartyget från ljust rött till mörkt violett, färgförändring av hjärtmuskeln som tillhandahålls av fartyg (från ljust rött till vitt) och förekomst av ST-förhöjningar på EKG. Under reperfusion, förändringar av färgen försvinner direkt. Håll hjärtat våt med en 37 ° C, saltlösning blötläggas, bit av absorberande bomull hela (se även figur 1). Välj din ischemi tid enligt din primära intresse. I själva verket, för studier av hjärtskyddande effekter av IP, skulle det vara idealiskt att använda en ischemi tid i samband med en infarkt storlekar av cirka 30 till 40% av AAR. Således skulle det vara möjligt att påvisa förändringar i båda riktningarna, t.ex. mindre infarkt storlekar med hjärt-IP eller större storlekar infarkt med en experimentell behandling eller en specifik gen radering. Dessutom möss med en infarkt på mindre än 50% överlever oftast försöket, medan infarkt storlekar på 60 till 80% är ofta inte överlevde och djuren dör innan reperfusion tiden är klar. Med vår modell 10 minuter av ischemi följt av 2 timmars reperfusion resultera i en infarkt storlek på 3,5 ± 1,3% av AAR. Däremot en ischemi på 60 minuter resulterar i en genomsnittlig infarkt storlek på 42 ± 5,2% av AAR (p <0,01) 39. Därför anser vi en 60 minuters ischemi som ideal för att studera förändringar i båda riktningarna. Ändå kanske du måste justera ischemi tiden i gen riktade möss med en bryta fenotyp. Välj rätt reperfusion tid. Den reperfusion tid är oerhört viktigt för TTC färgning. Den färglösa färgen reduceras till en tegel-rödfärgad fällning av dehydrogenaser i närvaro av co-enzymet NADH. Döende celler förlorar sin förmåga att behålla NADH och är därför avgränsas så bleka områden inom röda färgade livskraftiga hjärtmuskeln. Infarkt storlek avgränsning av TTC kräver att NADH har tvättats ut helt från nekrotiska området. Men om reperfusion inte är tillräckligt lång, får infarkt storlek avgränsning av TTC färgning resulterar i en underskattning av den faktiska infarkt storlek 43. I våra händer, efter en ischemi på 60 min, infarkt storlek mätningen ökade från 11,5 ± 4,5% efter 30 minuter till 42,2 ± 5,1ter 120 minuter. Ingen ytterligare ökning av infarkt storlek kunde detekteras med längre reperfusion gånger (240 minuter) 39. Därför rekommenderar vi en 2 timmars reperfusion period som verkar också rimligt mot bakgrund av hjärt-enzym determination.If du överväga ischemi konditioneringsfasen rekommenderar vi 4 cykler av IP (5 min ischemi, 5 min reperfusion), följt av en ischemi på 60 min och en reperfusion på 2 timmar. Under dessa förhållanden var IP-associerad med en 3,2-faldig minskning av infarkt storlek från 42,2 ± 5,1% till 13,3 ± 3,3% av AAR 39. På grund av den hängande vikten systemet, kan olika förkonditionering regementen lätt tillämpas. 3. Fastställande av riskområdet (AAR) och hjärtinfarkt storlek Efter induktion av en hjärtinfarkt (med eller utan IP), är området perfusion av LCA (riskområden AAR) och storleken på infarkt i sig kommer att fastställas med hjälp av en målningsteknik. Därefter kommer infarkt då beräknas i procent av hjärtinfarkt jämfört med AAR. För att göra detta, är en tidigare beskrivits dubbel målningsteknik med Evans blå och triphenyltetrazolium klorid (TTC) används 44. Bestäm AAR genom retrograd injektion av 1% Evans blå färg i aorta medan LCA är ockluderade. Alternativt, om en carotis kateter är på plats, använd den här rutten för Evans Blue injektion. Evans Blue kommer att färga alla hjärtinfarkt vävnad blå, utom AAR. Det är avgörande för detta steg för att undvika luftbubblor i katetern, eftersom de skulle injiceras i kranskärlscirkulation och förhindra Evans blå färgning. Före Evans blå färgning du kanske vill samla in blod för hjärt-enzym mätningar. Dessutom är borttagning av blod genom att injicera 5 ml koksaltlösning via en aorta-eller carotis kateter rekommenderas. Excise hjärtat och tvätta i iskallt 0,9% koksaltlösning Bädda in 2% agaros. Använd inte hett agaros eftersom detta kommer att hindra framgångsrika färgning. Efter 30 minuter vid 4 ° C (eller 15 minuter -20 ° C), skär i hjärtat i skivor 1 mm med ett hjärta matris eller mikrotomen. Om du placerar hjärtat i frysen undvika torra frysning som leder till icke färgade hjärtan. Inkubera skivor med 1% TTC vid 37 ° C i 10 min med en 15 ml blå keps i ett vattenbad. Detta gör det möjligt infarktområdet området som ska avgränsas som ett vitt område, medan livskraftiga vävnad fläckar rött. Fixera det färgade skivor med 10% fomaldehyde över natten. Genom att göra så är infarktområdet bättre kontrast förbättra kvaliteten på bilderna. Bestäm ytan i riskzonen (AAR) och infarkt storlek via PLANIMETRI med NIH 1,0 Image 45. Beräkna procent av infarktzonen hjärtmuskeln från området i riskzonen. 4. Hjärtat Enzyme Mätning På grund av begränsningar i samband med TTC färgning rekommenderar vi som extra avläsning för hjärtinfarkt svårighetsgrad bestämning av kardiellt troponin I (cTnI) nivåer i serum hos möss. Blodet kommer att erhållas från portalen ven och serum cTnI nivåer bestäms sedan med en kvantitativ snabb cTnI-analysen (Life Diagnostics, Inc., West Chester, PA, USA). 5. Representativa resultat: Figur 1. (A) Modell av hjärt-IP med hjälp av en hängande vikt system av koronar ocklusion. Denna teknik kräver inte en knut för koronar ocklusion. (B, C) Kirurgiska setup. (D) Bild på en mus hjärta med vänster kranskärl (LCA, pilar) efter ocklusion. Visuell identifiering av LCA är nödvändig för ligation och ischemisk prekonditionering i möss. En 8,0 nylon sutur placeras runt LCA 1-2 mm under den vänstra förmaket. Den sutur träs genom ett litet plaströr (*). I slutet av varje sutur är ansluten till en liten vikt (1g) och sutur placeras över stavarna på båda sidor. (E) Fastställande av AAR efter LCA ocklusion och bakåtsträvande injektion av Evans blå färg i aorta. Den AAR förblir ofärgade medan resten av hjärtmuskeln är blå. Efter inkubation av AAR vävnad med TTC, den infarktområdet målat vit, medan livskraftiga vävnad färgas röd.