Den Virochip är en pan-virus microarray utformat för att samtidigt upptäcka alla kända virus och virus roman på grundval av bevarade sekvenshomologi. Här visar vi hur man driver ett Virochip analys för att analysera kliniska prover för förekomst av både kända och okända virus.
Diagnosen av viral orsaker till många infektionssjukdomar är svårt på grund av den inneboende sekvens mångfalden av virus samt den pågående framväxten av nya virala patogener, till exempel sars coronavirus och 2009 pandemiska H1N1 influensavirus, som inte upptäckas med traditionella metoder. För att möta dessa utmaningar har vi utvecklat tidigare och validerat ett pan-virus microarray plattform som kallas den Virochip med kapacitet att upptäcka alla kända virus och nya varianter på grundval av bevarade sekvenshomologi 1. Använda Virochip har vi identifierat hela spektrumet av virus i samband med luftvägsinfektioner, inklusive fall av oförklarlig kritiska sjukdom hos inlagda patienter som har en känslighet motsvarande eller bättre än konventionella kliniska tester 2-5. Den Virochip har också använts för att identifiera nya virus, inklusive sars coronavirus 6,7, en roman rhinovirus klad 5, XMRV (ett retrovirus kopplad till prostatacancer) 8, aviär bornavirus (orsaken till en wasting disease papegojor) 9, och en roman cardiovirus hos barn med lung-och diarrésjukdom 10. Den nuvarande versionen av Virochip finns till en Agilent microarray-plattform och består av ~ 36 tusen sonder härrör från mer än ~ 1500 virus i GenBank och med december 2009. Här kan vi visa de olika stegen i behandlingen en Virochip analys från början till slut (~ 24 timmars handläggningstid), inklusive prov nukleinsyra extraktion, PCR-amplifiering med slumpmässiga grundfärg, fluorescerande färg bolagsordningen och microarray-hybridisering, skanning och analys.
Den Virochip protokoll som beskrivs här är komplex och kräver en noggrann och skicklig forskning tekniker. Korrekt reagens koncentrationer och villkor för PCR, märkning och hybridisering är kritiska. Den Virochip protokoll kan enkelt modifieras för att rymma en analys av sjuk vävnad med hjälp av en vävnad extraktion metod såsom TRIzol (Invitrogen) för nukleinsyra extraktion. Givare kan läggas till eller tas bort efter behov för att uppnå önskad spektrum och bredd täckning, till exempel, kan prober för detektion av nonviral mål såsom bakterier och svampar skall utformas och läggas "on-the-fly". Några tillämpningar av Virochip analysen för närvarande under utveckling inbegriper ett brett spektrum virusdiagnostik i den kliniska laboratorium, utbrott utredning, renhet screening av läkemedel och vacciner, och nya virala patogener upptäckt.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar David Wang, Anatolij Urisman, Amy Kistler, Kael Fischer, Patrick Tang, och Alexander Greninger för den inledande utvecklingen och optimering av Virochip protokollet. Detta arbete stöds av en NIH K08 bidrag och Abbott Discovery Award (till CC) och Howard Hughes Medical Institute (till JLD).
Name of reagent / material | Name of reagent / material |
---|---|
PrimerA | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3′ |
Primer B | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-3′ |
RT Master Mix (5 μL) | 2 μL 5X RT buffer |
1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
1 μL water | |
0.5 μL 0.1M DTT | |
0.5 μL SSIII RT (Invitrogen) | |
Sequenase Mix (5 μL) | 1 μL 5X Sequenase buffer |
3.8 μL water | |
0.15 μL Sequenase (USB Corporation) | |
Rd B PCR Master Mix (45 μL) | 5 μL 10X PCR buffer |
1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
1 μL 100 pmol / μL primer B | |
1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
37 μL water | |
Rd C PCR Master Mix (45 μL) | 5 uL 10X PCR buffer |
1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
1 μL 100 pmol / μL primer B | |
1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
37 μL water | |
Hybridization buffer (25 μL) | 1 μL 25X fragmentation buffer (Agilent) |
5 μL 5X blocking buffer (Agilent) | |
9.5 μL (or amount to normalize) of Cy3-labeled sample | |
Add water to total volume of 25 μL | |
Agilent Virochip microarray | license pending; available from Chiu laboratory, UCSF |