Расширение, очистки и функциональной оценки периферической крови человека клетки NK

Summary

Здесь мы опишем метод эффективно расширить и очистить большое количество человеческих NK клеток и оценить их функцию.

Abstract

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).

NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day ¹. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.

The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone ². Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine ³. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood ⁴. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.

Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells⁵ without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days⁶. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)⁷, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening⁸. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL15⁹.

Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Protocol

1. Выделение МНПК от Баффи Coat Мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) получаются плавучей центрифугирования плотности на Ficoll-Paque от здоровых доноров лейкомассы образцы полученных лейкафереза. Ficoll-Paque центрифугирования делается как протокол на одного производителя с незначительными изменениями. Добавить PBS к нормальной донорской крови-банк лейкомассы до конечного объема 140 мл (типичное пальто Баффи объем 40-70 мл). Слой 35 мл образца пальто Баффи на 15 мл Ficoll-Paque (4 трубы). Центрифуга при 400g в течение 20 минут без тормозов. Восстановление МНПК от Ficoll-Paque: плазма интерфейс, не выбрасывайте эритроцитов на дне Ficoll-Paque. Вымойте МНПК три раза PBS, центрифугирования каждый раз при 400g в течение 10 минут. МНПК могут быть использованы непосредственно для НК расширения ячейки на этом этапе или NK клетки могут быть выделены путем RosetteSep (раздел 4) Оставшиеся МНПК могут быть заморожены в ФБС, содержащего 10% ДМСО в жидком азоте. Аспирируйте Ficoll и собирать эритроциты, начиная с шага 5 на две трубки центрифуги 50 мл, мыть три раза PBS (добавляют к 50 мл отметки), каждый раз аспирата супернатант скимминга верхней части слоя РБК удалить гранулоцитов. Эритроциты могут быть использованы непосредственно для RosetteSep  очистки НК-клеток (см. раздел 4) или храниться в равном объеме решение Alsever это при 4 ° C для дальнейшего использования (эритроциты можно хранить в течение не более 4 недель). 2. Н. К. сотовый расширения Расширение NK клетки может быть начато использование МНПК или очищенной NK клеток. Количество МНПК использоваться для расширения может варьироваться в зависимости от количества НК клетки желаемого в конце трехнедельного расширения, обратитесь к представителю результаты разделе. (См. примечание 1) СТИМУЛЯЦИЯ 1 День 0 Для каждого 5×10 6 МНПК быть расширен, считать и облучать 10×10 6 К562 CL9 mIL21 с помощью гамма-облучатель при 100 Гр. Сообщение облучения, мыть клетки с PBS и ресуспендируют в НК ячейки расширения носителя (NKEM). Семенной 5×10 6 МНПК с 10х10 6 облученных К562 CL9 mIL21 (1:2) в 40 мл NKEM в T75 колбу и поместить его в вертикальном положении в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2. Дни 3 и 5 Восстановление клетки центрифугированием при 400g в течение 5 мин и заменить половину средств массовой информации со свежими NKEM (добавление свежей Ил-2 для всего объема средств массовой информации) и продолжить культуры. СТИМУЛЯЦИЯ 2 День 7 Подсчитайте количество клеток в культуре в конце недели. Отложите 5х10 5 клеток для фенотипирование методом проточной цитометрии (см. примечание 2) Для каждого 5×10 6 ячеек, которые будут restimulated, считать и облучать 5×10 6 К562 CL9 mIL21 с помощью гамма-облучатель при 100 Гр. Добавить равное количество облученных К562 CL9 mIL21 (1:1) и ресуспендируют в NKEM на 2.5×10 5 всего клеток / мл (см. Примечание 3). Семенной клеток в колбах T75 (максимум 50 мл на флакон). Дни 10 и 12 Подсчитайте количество клеток. Изменение всей СМИ со свежими NKEM на основе числа клеток (см. Примечание 3). День 14 В конце две недели расширения подсчета количества клеток в культуре. Отложите 5х10 5 клеток для фенотипирование методом проточной цитометрии (см. примечание 2) Если экспансия началась с МНПК NK клетки могут быть очищены на данном этапе расширение с помощью протокола RosetteSep очистки (см. раздел IV). Если расширение началось из очищенных натуральных киллеров переходите к стимуляции 3. После очистки отложить 5х10 5 клеток для фенотипирование методом проточной цитометрии для проверки чистоты NK клеток (как в шаге 8). Приступить к стимуляции 3, используя все очищенные клетки NK (См. примечание 4). СТИМУЛЯЦИЯ 3 Ресуспендируют NK клеток с облученным К562 CL9 mIL21 (1:1) в NKEM на основе числа клеток (см. Примечание 3). Дни 17 и 19 Подсчитайте количество клеток. Изменение СМИ со свежими NKEM на основе числа клеток (см. Примечание 3). День 21 По истечении трех недель расширения подсчета количества клеток в культуре. Восстановление 1×10 6 клеток для анализа потока цитометрии для полного ячейки NK панели антител фенотипирование (см. Таблицу 1). Замораживание клеток в ФБС, содержащий 10% ДМСО при максимальной плотностью 5х10 7 клеток на флакон для будущего использования. 3. Н. К. сотовый Цитотоксичность Пробирной Оттепель флакон НК-клеток и семян NKEM, за день до ЧПrforming цитотоксичность анализа, чтобы восстановление. Для каждого НК анализа цитотоксичности клеток с использованием одной линии клеток-мишеней, 6×10 5 NK клеток и 3х10 5 клеток-мишеней не требуется (см. примечание 5). Подготовка CAM-Медиа путем разбавления кальцеин-AM (акции 1 мг / мл в ДМСО) в NKEM (См. примечание 6). Ресуспендируют 10 6 клетки-мишени в 1 мл CAM-медиа (см. Примечание 7). Инкубируйте в течение 1 часа при температуре 37 ° C, при периодическом встряхивании. Ресуспендируют NK клеток на 1×10 6 клеток / мл и добавить 200uL НК клеточной суспензии для каждого из 3 скважин U-дно 96-луночного планшета соответствующие до 10: 1 E: T соотношение показано на рисунке 1. (См. Примечание 8) Добавить 100 мкл полной СМИ, чтобы все оставшиеся лунки за исключением "Максимум". Добавить 100 мкл 2% Тритон Х-100 на "Максимум". Выполните серийные разведения NK клеток для последующей 5 E: T отношений путем передачи 100 мкл клеток каждый раз, хорошо перемешать. Отменить 100 мкл из последних скважин (E: T отношение 0.3125:1). Через 1 час загрузки кальцеин, мыть клетки-мишени в NKEM дважды, центрифугирования в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту. (См. Примечание 9) Пересчет клеток-мишеней и ресуспендируют в 1х10 5 клеток / мл. Добавить 100 мкл клеток-мишеней в каждую лунку (1×10 4 / а). Центрифуга в течение 1 мин на 100 г инициировать ячейки контакта. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 4 часов. Смешайте культуры осторожно с помощью пипетки с 100 мкл pipetter для того, чтобы равномерно приостановить выпущен кальцеин, замедления вращения пластины на 100 г в течение 5 минут для осаждения клеток и передачи 100 мкл надосадочной к новой пластинкой заботясь, чтобы избежать пузырей. Поп пузыри, которые могут форму с помощью тонкой иглы. Прочитано пластины с использованием флуоресцентных читателя пластины (возбуждение фильтра 485 нм, эмиссия фильтр 530 нм). Нижняя читать рекомендуется. Рассчитать процент Конкретные Лизис по формуле [(тестовый релиз-спонтанное выделение) / (максимальное релиз – спонтанное выделение)] х 100. 4. Н. К. сотовый Очистка RosetteSep Возьмите 100-кратного избытка эритроцитов, что и МНПК или расширенных клеток, в 50 мл трубки (100:1 РБК: МКПК). Если вы используете свежие эритроциты приступить непосредственно к следующему шагу, или если эритроциты хранились в растворе Alsever с, подсчитать количество эритроцитов и промыть соответствующий (100-кратного избытка) количество эритроцитов с PBS с добавлением 2% ЭТС три раза, центрифугирования при 1200 оборотов в минуту в течение 10 минут каждый раз. Комбинат эритроцитов с МНПК с шагом 1,7 или расширенных клетки шагом 2,10 в PBS + 2% ЭТС для конечного объема 1 мл на 5×10 7 из МНПК или расширенных клеток. Добавить 1 мкл из RosetteSep  человеческих клеток NK обогащению Коктейль на 1×10 6 из МНПК или расширенных клеток. Хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут с нежным смешивания каждые 5 минут. Добавить равным объемом PBS + 2% смеси FBS мягко и слой поверх Ficoll-Paque. Повторите шаги Ficoll-Paque центрифугирования описано для изоляции РВМС (раздел I). Граф Н. К. клетки восстановились после очистки и отложите 5×105 клеток для phenotpying методом проточной цитометрии для НК ячейки чистоты (Шаг 8). 5. Примечания ПРИМЕЧАНИЕ 1. НК-клеток может быть расширен непосредственно из МНПК, или от RosetteSep  очищенной NK клеток. Мы отметили, аналогичные эффективность расширения, но некоторые доноры могут иметь очень низкие НК номера сотовых в результате чего трудности очистки от RosetteSep до расширения. ПРИМЕЧАНИЕ 2. Мы обычно используют CD56-FITC, CD16-PE и CD3-PE-Cy5 для фенотипирование в ходе расширения, перечисляя НК-клеток, как те, которые CD3-отрицательных и CD16-CD56 или-положительными. ПРИМЕЧАНИЕ 3. При каждом изменении СМИ или стимуляции, ресуспендирования клеток в 2,5 х 10 5 / мл держать РВМС / NK на номера сотовых или менее 2 миллионов на мл на пике стадии расширения. Это позволит предотвратить истощение питательных веществ и помочь в достижении максимального расширения и выживания. Примечание 4. НК скорость расширения доноров зависимых и в конце стимуляции 1 или 2 части клетки могут быть заморожены, а часть еще больше расширить в зависимости от экспериментальных нужно. У нас были хорошие успехи в использовании замороженных клеток для разложения на более позднее время. ПРИМЕЧАНИЕ 5. В целях обеспечения права на ошибку мы рекомендуем использовать не менее 7х10 5 NK клетки ресуспендировали в 700 ULS из NKEM и 4×10 5 кальцеин-АМ окрашенные клетки-мишени ресуспендировали в 4 мл NKEM для создания цитотоксичность анализа. При использовании многоканальной пипетки для посева клеток-мишеней больших объемов ячеек (до 6×10 5 в 6 мл) могут потребоваться в зависимости от размера средств массовой информации бассейна используется. Также рекомендуется НК номера сотовых специально для E: T отношения шоу в протокол, для использования более высоких E: T соотношение увеличенияНК номера сотовых на мл соответственно (например, для 40:1 E: T соотношение использования 4×10 6 клеток / мл) ПРИМЕЧАНИЕ 6. Рекомендуется выполнять предварительные кальцеин-АМ загрузки титрования для линии клеток-мишеней выбора, используя следующие разведения 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 и 1:100 для достижения оптимальной разницу между максимальной и спонтанное освобождение. ПРИМЕЧАНИЕ 7. При использовании приверженцем клеточной линии, как цель, сначала подготовить суспензии отдельных клеток с использованием не-ферментативной клеточной диссоциации буфера. При выполнении ADCC, готовят дубликаты трубки клеток-мишеней в CAM-медиа. ПРИМЕЧАНИЕ 8 При выполнении ADCC, добавить же NK клетки 3 скважины соответствующей 10:01 E:. Т для ADCC. Повторите эти действия для дополнительных доноров. Повторите эти действия для дополнительных клеток-мишеней. Примечание 9. При выполнении ADCC эксперимента, после 45 минут загрузки кальцеин, добавьте 10ug из антител, специфичных для стимулирования ADCC против клеток-мишеней. После 15 минут, промойте клетки-мишени в полной среде в два раза, центрифугирования в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту. Ресуспендируют клеток 1х10 5 клеток / мл и приступить к следующему шагу в протокол. 6. ПРЕДСТАВИТЕЛЬ РЕЗУЛЬТАТЫ Рисунок 2. Когда расширение выполняется согласно схеме, описанной выше, с использованием 5×106 МНПК в качестве исходного материала, типичные НК клетка дает диапазон от 1×10 9 до 10 10 клетки (донора зависимыми изменчивость). На рисунке показана НК ячейки раза расширения (п = 19) по сравнению с НК клетки, присутствующие в оригинальный продукт (средний + / – квартиль). Рисунок 3. Расширены клетки NK выражения различных NK-клеточных рецепторов, которые сопоставимы с невспененные первичной NK клеток с несколькими исключениями (CD11b, CD160 и CD244). Рисунок 4. МНПК восстановление после Баффи пальто доноров зависимым и может варьироваться от 6 до 300×10 800×10 6. NK клетки могут включать в себя 2% – 18% МНПК. Для очистки RosetteSep расширенного клеток, восстановления чистых натуральных киллеров на 14 день составляет от 40-70%. Следуя рекомендуется протокол расширения и очистки, Н. К. чистоты ячейка 99% можно ожидать. Рисунок 5. Расширенное НК-клеток показали, цитотоксичности против ряда опухолевых клеточных линий, включая нейробластома, борьбы с отмыванием денег, остеосаркома и меланома (представительных AML убийство показано в процентах конкретных лизис).

Materials

NK Cell Expansion and Activation Media (NKEM)

• 90% RPMI 1640 (Cellgro)
• 10% Fetal Bovine Serum (Gibco)
• 1x Penicillin / Streptomycin (Cellgro)
• 1x L-Glutamine (Gibco)
  • Filter Sterilize media before use.
• 50 U/ mL IL2 (Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc)
  • – Diluted from a 200 IU/μl stock. Add IL2 to desired amount of media just before use each time.

PBMC and NK Cell Isolation

• Ficoll-Paque (GE Healthcare)
• Alsever’s solution (Sigma)
• RosetteSep Human NK Cell Enrichment Cocktail (Stemcell Technologies)

NK Cell Cytotoxicity Assay

• Calcein-AM (Invitrogen)
  • Stock solution is at 1mg/ mL, store frozen in 50 μL aliquots. Dissolve in NKEM media to achieve desired dilution for cell staining.

Antibodies

The list of antibodies used for NK cell phenotyping are listed in table below;

	Antibody	Volume per Test	Company	Catalog number
Tube 1	Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	555748 555749 557224 340442
Tube 2	CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 558407 558563 557991 555341 557710
Tube 3	CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2/3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen R&D Systems Miltenyi Biotec R&D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071
Tube 4	CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 555388 555341 558664
Tube 5	CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 559789 555341 51-1609-42
Tube 6	CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 550816 555341 17-1979-42