एक साधारण मक्खियों में इथेनॉल संवेदनशीलता उपाय

Summary

एक साधारण पर इथेनॉल के sedating प्रभाव को मापने परख<em> ड्रोसोफिला</em> मक्खियों, पलटा ठीक करने के नुकसान पर आधारित है, में वर्णित है.

Abstract

इथेनॉल के कारण की कम खुराक के लिए अति सक्रिय हो जाते हैं, जबकि उच्च खुराक sedating हैं मक्खियों. एक दिया मक्खी तनाव के इथेनॉल प्रेरित बेहोश करने की क्रिया के लिए संवेदनशीलता कि तनाव इथेनॉल वरीयता के साथ सहसंबद्ध है, और इसलिए बेहोश करने की क्रिया शराब प्रतिक्रियाएं और पीने के आनुवंशिकी के अध्ययन के लिए एक अत्यधिक प्रासंगिक उपाय है. हम मक्खियों को बेनकाब करने के लिए इथेनॉल और उसके मादक प्रभाव को मापने के लिए एक सरल तरीका प्रदर्शित करता है. परख हम वर्णन तीव्र संवेदनशीलता, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इथेनॉल सहिष्णुता दोहराने जोखिम से प्रेरित निर्धारित कर सकते हैं. यह एक तकनीकी रूप से शामिल सेटअप की आवश्यकता नहीं है, और इसलिए किसी भी प्रयोगशाला में बुनियादी मक्खी संस्कृति उपकरणों के साथ लागू किया जा सकता है.

Protocol

1. जोखिम कक्ष बनाना एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर आधे में एक शीशी प्लग कट. वैकल्पिक रूप से, कपास गेंदों का उपयोग करें. शीशी प्लग आधा, या कपास की गेंद के एक भोजन शीशी के नीचे एक चिकनी सतह है कि मक्खियों अंदर अटक नहीं होगा बनाने के लिए, पुश यदि एकाधिक जोखिम कक्षों बना रही है, यकीन है कि शीशी प्लग और भोजन प्रत्येक कक्ष में एक ही मात्रा ले. शीशी की तरफ एक निशान इस सुविधा कर सकते हैं. 2. मक्खियों उजागर एक लिंग, 1-5 दिनों उम्र, खमीर के बिना नियमित रूप से भोजन शीशियों में प्रदर्शन से पहले दिन के 8 मक्खियों लीजिए. उन्हें कोड में लेबल, जैसे कि experimenter वास्तविक जीनोटाइप / तनाव प्रयोग किया जाता करने के लिए अंधा है. स्थानांतरण जोखिम कक्षों में दोहन द्वारा आठ मक्खियों. Anesthetize नहीं करो. इसे आसानी से दृश्यमान बनाने के 200 सबूत इथेनॉल के लिए, जैसे एसिड नीले 9, भोजन डाई की एक छोटी राशि जोड़ें. एक शीशी प्लग के नीचे कोट, या कपास की गेंद 0.5 मिलीलीटर इथेनॉल के साथ. जोखिम शीशी में इथेनॉल प्लग डालें. सुनिश्चित करें कि शराब शीशी में नहीं, और शीशी की दीवार की ओर का सामना करना पड़ रहा है. गिनती टाइमर शुरू करो. 3. रिकॉर्ड नशा इथेनॉल प्रेरित टाइमर के बाद प्रत्येक मिनट शुरू कर दिया है, पीठ पर जोखिम कक्ष का नल मक्खियों को डराना और उन्हें दस सेकंड के लिए निरीक्षण. प्रत्येक मिनट के लिए स्थिर मक्खियों की संख्या रिकार्ड. मक्खियों स्थिर रहे हैं अगर वे अपनी पीठ से नहीं मिल सकता, एक स्थान में रहते हैं, या तेजी से पूरे दस सेकंड प्रेक्षण अवधि के दौरान उनके पंखों कांपना. उत्तरार्द्ध मक्खियों को स्थिर माना जाता है क्योंकि इन मक्खियों के विशाल बहुमत तेजी से पंख आंदोलन की अवधि के बीच स्थिर हैं. मक्खियों स्थिर नहीं कर रहे हैं अगर वे अपनी पीठ प्राप्त कर सकते हैं और दूर और / या शीशी दीवार को चलना. जब 4 या अधिक मक्खियों स्थिर के रूप में दर्ज कर रहे हैं एक जोखिम परीक्षण समाप्त हो गया है. मक्खियों त्यागें और जोखिम कक्ष हवा बाद में पुन: उपयोग करने के लिए बाहर जाने हैं. 4. 50% बेहोश करने की क्रिया के लिए समय निर्धारित 50% (ST50) बेहोश करने की क्रिया के लिए समय इथेनॉल जोखिम के शुरू होने के बाद समय जब आठ मक्खियों के चार स्थिर रहना है. यह निम्नानुसार निर्धारित किया जाता है: या तो: माप पहले मिनट जब चार बिल्कुल मक्खियों स्थिर हैं. या: यदि कम से कम चार मक्खियों (Y1) एक समय मिनट (एक्स) इंगित करें, और अधिक से अधिक अगले मापने समय बिंदु पर (Y2) चार (मिनट के एक एक्स), तो रैखिक लगाना सूत्र का उपयोग ST50 पर स्थिर हैं: ST50 = (4 – Y1) / (Y2 – Y1) + एक्स 5. जोखिम सहिष्णुता निर्धारित दोहराएँ मक्खियों उजागर जंगली प्रकार के नियंत्रण अपने प्रयोग में इस्तेमाल किया तनाव के लिए ST50 (wt) निर्धारित करते हैं. मक्खियों की प्रयोगात्मक समूहों को बेनकाब करने के लिए ऊपर वर्णित के रूप में इथेनॉल. ST50 उनके (1) उपाय है, लेकिन को बेनकाब करने के लिए जारी जब तक आप समय 2x ST50 (wt) तक पहुँचने. मक्खियों को वापस एक खाली भोजन शीशी में, स्थानांतरण और 4 घंटे के लिए पकड़. मक्खियों पुनः पर्दाफाश, और जोखिम के 2 ST50 (2) निर्धारित है. सहिष्णुता निर्धारित X100 – (1 ST50 (2) / ST50 (1)) के रूप में सहिष्णुता% की गणना. 6. प्रतिनिधि परिणाम: यहाँ दिखाया, कुछ प्रतिनिधि परिणाम हम जीनोटाइप और खुराक प्रति मक्खियों के 6-8 शीशियों के साथ प्राप्त कर रहे हैं. यदि आपके मानक त्रुटि काफी बड़ा है, तो एक व्यवस्थित समस्या की संभावना हुई. सुनिश्चित करें कि इथेनॉल जोखिम कक्षों में चेहरे, और है कि कक्षों को उसी मात्रा. चित्रा 1. जंगली प्रकार की खुराक प्रतिक्रिया वक्र इथेनॉल की बढ़ती प्रतिशत उजागर करने के लिए मक्खियों. मक्खियों की आठ शीशियों खुराक और सेक्स के प्रति अवगत कराया गया. नर और मादा मक्खियों प्रत्येक खुराक (> 0.22 पी 2 तरह एनोवा) में एक ही ST50 दिखाने के लिए, जबकि खुराक भर ST50 बढ़ती इथेनॉल खुराक (पी <0.001) के साथ काफी कम हो जाती है. ध्यान दें कि अधिक भीड़ बोतलों से मक्खियों स्वस्थ बोतलों से उन लोगों की तुलना में काफी छोटा हो सकता है, और इस आकार का अंतर ST50 को प्रभावित कर सकते हैं कर सकते हैं. बीज 15-20 महिलाओं के साथ प्रत्येक बोतल 1-2 दिनों के लिए बिछाने के लिए बोतल प्रति इष्टतम लार्वा घनत्व मिलता है. चित्रा 2 या तो 90%, या 100% इथेनॉल के लिए मक्खियों उजागर. पहले से वर्णित सफेद rabbit1 mutation2 (पी <0.001, 2 – रास्ता एनोवा) इथेनॉल प्रतिरोध की वजह से reproduces. चित्रा 3. 100% इथेनॉल के लिए जोखिम को दोहराएँ, एक 4 घंटे की वसूली अंतराल से दूरी, दूसरी जोखिम (पी <0.001, बनती टी के बाद ST50 में एक उल्लेखनीय वृद्धि का कारण बनता हैपरीक्षण). ध्यान दें कि मक्खियों पहला प्रदर्शन (दो बार उनके न ST50 किया है इसी) के दौरान 24 मिनट के लिए खुल गए थे. समय (12 मिनट) की एक छोटी राशि के लिए एक्सपोजर फिर जोखिम (नहीं दिखाया डेटा है) पर एक ST50 में उल्लेखनीय वृद्धि का कारण नहीं था.

Discussion

इस प्रस्तुति में, हम एक सरल पिछले Bainton एट अल द्वारा वर्णित assays पर आधारित इथेनॉल प्रेरित नशा निर्धारित रेखांकित किया है. ^1, 2000 और Rothenfluh एट अल. 2006 ^2. चूंकि शराब प्रेरित बेहोश करने की क्रिया शराब पीने वरीयता ³ के साथ सहसंबद्ध है, इस परख शराब का उपयोग विकारों के अध्ययन के लिए प्रासंगिक है. परख वर्णित डराना प्रेरित नकारात्मक geotaxis पर आधारित है, और कैसे एक शराब जोखिम इस सहज प्रतिक्रिया के साथ हस्तक्षेप. जोखिम शुरू करने से पहले सुनिश्चित करें कि आपके सभी मक्खियों ऐसे डराना के लिए एक सामान्य प्रतिक्रिया दिखाने के लिए, यानी खाद्य शीशी में मक्खियों दोहन करने के बाद, वे सब नीचे से एक 10 सेकंड प्रेक्षण समय के भीतर बढ़ना चाहिए. कम नकारात्मक geotaxis होने मक्खियों के उदाहरण धमाके के प्रति संवेदनशील जब्ती ⁵ म्यूटेंट, और हरकत की कमी मक्खियों डोपामाइन ⁶ न्यूरॉन्स के अध: पतन की वजह से शामिल हैं.

हालांकि वर्णित परख अपेक्षाकृत सरल है, दो चर सबसे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सुनिश्चित करने का ध्यान योग्यता. सबसे पहले, सभी जोखिम शीशियों एक ही मात्रा में होना चाहिए. यह सुनिश्चित करें कि शीशी के नीचे भोजन + गेंद शीशी प्लग / कपास की एक ही मात्रा, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्लग इथेनॉल युक्त हर शीशी के लिए एक ही दूरी डालने शामिल बनाने शामिल हैं. इस परख के लिए एक पूरी तरह से खाली शीशी का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह अब ST50 मूल्यों की ओर जाता है है, परख के throughput कम है.

इस परख भी सहिष्णुता मक्खियों की राशि निर्धारित दोहराने इथेनॉल जोखिम पर विकसित के लिए उपयुक्त है. चर का एक नंबर जब दोहराने जोखिम कर माना जाना चाहिए. सबसे पहले, अंतर – जोखिम अंतराल यहाँ 4 घंटे के रूप में वर्णित है. इस चर, बदला जा सकता है, लेकिन हम अनुशंसा करते हैं कि यह नहीं हो सकता है, 2 घंटे से कम करने के लिए पहली जोखिम से इथेनॉल की निकासी सुनिश्चित है. Scholz एट अल देखें. ⁴ इथेनॉल सहिष्णुता के विकास और क्षय के कैनेटीक्स के लिए 2000. दूसरा चर पर विचार करने के लिए पहला प्रदर्शन की अवधि है. यह स्पष्ट रूप से नियंत्रण और प्रयोगात्मक मक्खियों के लिए ही होना है. हालांकि, यह इन दोनों उड़ उपभेदों दिया इथेनॉल का एक ही राशि में परिणाम नहीं हो सकता. बेहोश मक्खियों सक्रिय ^दो मक्खियों की तुलना में अधिक इथेनॉल को अवशोषित, इसलिए एक तनाव है कि पहले एक बाद में sedating तनाव की तुलना में एक उच्च खुराक प्राप्त हो सकता है sedates, और इस प्रकार अधिक एक उच्च प्रारंभिक खुराक की वजह से सहिष्णुता का विकास . हम दृढ़ता से पाठक सावधानी जब उपभेदों कि प्रारंभिक ST50 (1) में मतभेद दिखाने की सहिष्णुता विकास की तुलना.

परख हम यहाँ वर्णन को आसानी से और reproducibly शराब के लिए मक्खियों व्यवहार प्रतिक्रियाओं का निर्धारण करने में एक उपयोगी उपकरण है.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Exposure vials		www.flystuff.com	32-116
Plugs		www.flystuff.com	49-102
Acid Blue 9		Sigma	861146