Använda luciferas till bild bakteriella infektioner hos möss
Summary
Metoder för bioluminescence avbildning av bakteriella infektioner i levande djur beskrivs. Patogener är modifierade att uttrycka luciferas tillåta optiska hela kroppen avbildning av infektioner hos levande djur. Djurmodeller kan vara infekterade med luciferas uttrycka patogener och den därav sjukdomens förlopp visualiseras i realtid med bioluminescens avbildning.
Abstract
Imaging är en värdefull teknik som kan användas för att övervaka biologiska processer. I synnerhet kan förekomsten av cancerceller, stamceller, specifika immunförsvaret celltyper, virala patogener, parasiter och bakterier följas i realtid i levande djur 1-2. Tillämpning av bioluminescens imaging till studiet av patogener har fördelar jämfört med konventionella strategier för analys av infektioner i djurmodeller 3-4. Infektioner kan visualiseras inom enskilda djur över tid, utan att kräva dödshjälp att bestämma var och mängden av den sjukdomsalstrande. Optisk avbildning gör omfattande granskning av alla vävnader och organ, snarare än provtagning av platser som tidigare kända för att vara smittade. Dessutom kan riktigheten av ympning på specifika vävnader vara direkt bestämmas innan överföring av djur som utan framgång har inympats i hela experimentet. Variation mellan djur kan styras för, eftersom bildbehandling gör att varje djur som skall följas individuellt. Imaging har potential att kraftigt minska djurens antal behövs på grund av möjligheten att få data från flera tidpunkter utan att behöva prov vävnader för att bestämma sjukdomsalstrande belastning 3-4.
Detta protokoll beskriver metoder för att visualisera infektioner i levande djur använder bioluminescens bildhantering för rekombinanta stammar av bakterier uttrycka luciferas. Det Klicka skalbaggen (CBRLuc) och Firefly luciferases (FFluc) utnyttja luciferin som substrat 5-6. Ljuset som produceras av både CBRluc och FFluc har en bred våglängd från 500 nm till 700 nm, vilket gör dessa luciferases utmärkta reportrar för optisk avbildning i levande djurmodeller 7-9. Detta beror främst på våglängder av ljus är större än 600 nm krävs för att undvika absorption av hemoglobin och därmed resa genom däggdjur effektivt. Luciferas är genetiskt förs in i bakterier för att producera ljussignal 10. Möss är pulmonell inokuleras med självlysande bakterier intratracheally att tillåta övervakning av infektioner i realtid. Efter luciferin injektion, är bilder förvärvats med hjälp av IVIS Imaging System. Under bildbehandling, möss sövda med isofluran med ett XGI-8 Gas Anethesia System. Bilderna kan analyseras för att lokalisera och kvantifiera signalkälla, som representerar bakteriell infektion (n) och antal, respektive. Efter bildbehandling är CFU beslutsamhet utförs på homogeniserad vävnad för att bekräfta förekomsten av bakterier. Flera doser av bakterier används för att korrelera bakteriella nummer med luminiscens. Imaging kan tillämpas på studier av patogenes och utvärdering av effekten av antibakteriella substanser och vacciner.
Protocol
Discussion
Även efter dessa protokoll kommer oftast resulterar i bilder av hög kvalitet är det viktigt att tänka på några viktiga frågor för att få exakta och konsekventa data från imaging studier. Luminiscens bilder bör förvärvas som räknar från 600 till 60.000 för att säkerställa att signalen ligger över bakgrunden och kameran är inte mättad. Om signal som erhålls är lägre än 600 exponeringen villkor bör justeras för att öka räknas. Om signalen erhålls är över 60.000 kameran är mättad i vissa re…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Cirillo laboratoriet medlemmar för värdefulla diskussioner och hjälp under hela denna studie. Vi tackar Dr Joshua Hill och laboratoriet av Dr James Samuel för hjälp med under inspelningen av detta protokoll. Detta arbete har finansierats av bidrag 48.523 från Bill & Melinda Gates Foundation och beviljar AI47866 från National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isoflurane | VETONE | 501027 | ||
| Ketamine | Butler animal health supply | |||
| Xylazine | MP Biomedical | 158307 | ||
| Luciferin | GMT | LUCK-100 | ||
| Fetal plus solution | VOR tech pharmaceutical | |||
| Cathether (22G x 1”) | TERUMO | OX2225CA | ||
| Guide wire | Hallowell EMC | 210A3491 | ||
| Octocope with speculum | Hallowell EMC | 000A3748 | ||
| Xenogen IVIS system | Caliper Life Sciences | |||
| XGI-8-gas Anesthsia System | Caliper Life Sciences | |||
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | |||
| Transparent nose cones | Caliper Life Sciences | |||
| Light baffle divider | Caliper Life Sciences |
References
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).
- Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors. Science. 244, 700-702 (1989).
- Wet, J. R. d. e., Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).
- Hastings, J. W. Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review. Gene. 173, 5-11 (1996).
- Zhao, H. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
- Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).
