从小鼠胚胎肾肾区细胞的分离和培养
Summary
在这份报告中，我们描述了一种从小鼠胚胎肾，可用于研究规范发展肾干/祖细胞的信号转导通路的祖细胞小生境的隔离和文化的方法。这些培养的细胞是高度开放的小分子和重组蛋白治疗，更重要的还的病毒转导，这使得候选人途径的有效操纵。
Abstract
胚胎发育的肾脏已被广泛研究，作为一个在器官的上皮 – 间质相互作用的模型，并获得先天性肾脏疾病的起源的认识。最近，转向幼稚走向肾命运的胚胎干细胞的可能性已在再生医学的新兴领域的探索。在小鼠的遗传研究发现肾脏发育所需的多种途径，以及最近在器官的基因转录的一个全局编录生成http://www.gudmap.org/，众多候选人监管机构提供必要的发展职能。鼠肾器官，可以在器官培养研究，许多报告都采用这种方法申请候选蛋白或撞倒使用siRNA或morpholinos的候选基因的表达分析的结果。但是，信号的研究，在发展中国家肾干/祖细胞的分化与重建的调节器官培养的适用性是有限的，作为培养器官包含一个紧凑的细胞外基质的限制大分子物质和病毒颗粒的扩散。为了研究细胞信号转导事件的影响在我们已经开发出一种主要的电池系统，建立发展中国家的肾脏上皮细胞的分化诱导剂的隔离体外肾区或祖细胞小生境的肾脏干/祖细胞的利基。利用有限的酶消化，肾区细胞可以选择性地发展E17.5肾脏中解放出来。过滤后，这些细胞可以培养使用优化条件为不规则的单层。标记基因的分析表明，这些文化含有一种类型的细胞在体内的肾区的特点的分布，并保持适当的标记基因表达的文化期间。这些细胞是高度开放的小分子和重组蛋白治疗，更重要的还的病毒转导，极大地方便了候选干/祖细胞调节作用的研究。基本细胞增殖和细胞死亡以及肾干/祖细胞在体内的特征分子标记表达的变化，如生物参数，可成功地用作实验的结果。在我们实验室正在进行的工作，使用这本小说的原电池技术的目的是发现肾干/祖细胞的自我更新与分化调控的基本机制。
Protocol
Discussion
在这个协议中，我们描述了一种方法，从胚胎肾肾区细胞分离和培养。这是最初作为一个肾区（空白等，2009）研究细胞BMP7治疗的效果的一部分出版了方法的发展。在最初的研究中，进行了一系列的实验来表征细胞内的NZC人口代表类型。简单地说，从遗传记者NZCs皮质基质（+ / lacZ的 Foxd1）（Hatini等 ，1996）的净化，收集管（HOXB7 + / CRE; R26 的 rEYFP）（Srinivas</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是支持R01 DK078161 NIDDK（LO），美国心脏协会（AB），瑞典和Kungliga Fysiografiska Sällskapet，隆德，瑞典（UB）温纳 – 格伦基金会博士后奖学金。缅因州医疗中心研究所的核心设施，病理组织学，生物信息学和流式细胞仪（2P20RR18789 – 06支持）和MMCRI动物基金提供了额外的支持。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz | RS-4905 | 2 pairs required | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 578 001 | Wear mask | |
| Porcine Pancreatin | Sigma | P8096 | Wear mask | |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza | 17-513F | With Mg & Ca | |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | ||
| HBSS | Gibco | 14175 | ||
| KSFM | Gibco | 10724-011 | without added growth factors | |
| L-Glutamine 200mM | Sigma | G7513 | Use @ 1% v/v | |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma | P4333 | Use @ 1% v/v | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder | |
| 24 well culture plate | Thermo Scientific | 142485 | Nunclon | |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza | 17-512F | ||
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | ||
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml | |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Use @ 4 % w/v | |
| Triton X100 | VWR | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v | |
| PBS | Sigma | P3813 | Supplied as powder | |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v | |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 | |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 | |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
| Glycerol | EMD | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use “DNase on column” protocol | |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Falcon | 357575 |
References
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