Embriyonik Fare Böbrek Nefrojenik Zone Hücreleri İzolasyon ve Kültür
Summary
Bu yazıda, gelişmekte olan böbrek kök / progenitör hücreleri düzenleyen sinyalizasyon yolaklar çalışma için kullanılabilir embriyonik fare böbrek progenitör hücre niş izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kültür hücreleri küçük molekül ve rekombinant protein tedavisi için son derece erişilebilir ve önemlisi de aday yollarının etkin bir şekilde müdahale etmenizi sağlar viral iletimi,.
Abstract
Böbrek embriyonik gelişim yoğun organogenez epitel mezenkimal etkileşim için bir model olarak ve doğuştan böbrek hastalığı kökeni anlayış kazanmak için her iki çalışılmıştır. Daha yakın zamanlarda, nefrojenik kaderi karşı naif embriyonik kök hücreleri direksiyon olasılığı, rejeneratif tıp ortaya çıkan alanında incelenmiştir. Fareyi genetik çalışmalar böbrek gelişimi için gerekli olan çeşitli yollar belirledik ve organ gen transkripsiyon son zamanlarda küresel bir katalog oluşturuldu http://www.gudmap.org/, temel gelişim fonksiyonlarının çok sayıda aday düzenleyiciler. Kemirgen böbrek Organogenez organ kültürü incelenecek ve birçok rapor, ya da aday proteinleri uygulayarak veya aday genler siRNA veya morpholinos kullanarak ifade aşağı vurma sonuçlarını analiz etmek için bu yaklaşım kullanılır. Kültürlü organları, makromoleküllerin ve virüs parçacıkları kompakt bir ekstrasellüler matriks sınırlayan difüzyon içeren Ancak, gelişmekte olan böbrek kök / progenitör hücre farklılaşması karşısında yenilenmesini düzenleyen sinyal çalışmaya organ kültürü uygulanabilirliği sınırlıdır. Hücre farklılaşma epitel indükleyicisi izolasyonu gelişmekte olan böbrek ex vivo nefrojenik bölge veya progenitör hücre niş oluşturan bir birincil hücre sistemi geliştirdik böbrek kök / progenitör hücre niş etkileyen olaylar sinyalizasyon incelenmesi. Sınırlı enzimatik sindirim E17.5 az gelişmekte olan böbrekler, nefrojenik bölge hücreleri seçici kurtarılmış olabilir. Işleminden sonra, bu hücreler optimize koşulları kullanarak düzensiz bir tek tabaka olarak yetiştirilebilir. Marker gen analizi, in vivo nefrojenik bölge karakteristik hücre tipleri bu kültürlerin bir dağıtım içerdiğini gösterir ve kültür döneminde uygun işaretleyici gen ekspresyonu korumak . Bu hücreler küçük molekül ve rekombinant protein tedavisi son derece erişilebilir ve daha önemlisi de aday kök / progenitör hücre düzenleyici etkileri çalışmanın büyük ölçüde kolaylaştırır viral iletimi,. Temel hücre çoğalması ve hücre ölümü gibi in vivo olarak nefron kök / progenitör hücrelerinin karakteristik moleküler belirteçler ifade değişiklikleri gibi biyolojik parametreler deneysel sonuçların başarılı olarak kullanılabilir. Bu romanda ana hücre tekniği kullanılarak laboratuarda devam eden çalışmaları nefron kök / progenitör hücrelerin kendini yenileme karşı farklılaşma yönetmelik düzenleyen temel mekanizmaları ortaya çıkarmak için amaçlamaktadır.
Protocol
Discussion
Bu protokolde, embriyonik böbrek nefrojenik bölge hücreleri izole ve kültür bir yöntem açıklanmaktadır. Başlangıçta nefrojenik bölge (Boş ve ark, 2009) hücreleri BMP7 tedavi etkileri bir çalışmanın parçası olarak yayınlanan bir yöntem geliştirilmesi. İlk çalışmada, NZC nüfus içinde temsil edilen hücre tipleri karakterize etmek için bir dizi deney yapılmıştır. (Srinivas ve ark, 2001; Yu ve ark; Kısaca, kortikal stroma (Foxd1 + / lacZ) (. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, NIDDK (LO), Amerikan Kalp Birliği (AB), İsveç ve Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, İsveç (UB) Wenner-Gren Vakıflar doktora sonrası burslar R01 DK078161 tarafından desteklenmiştir. Histopatoloji, Biyoinformatik ve FACS Maine Tıp Merkezi Araştırma Enstitüsü çekirdekli tesisleri (2P20RR18789-06 tarafından desteklenen) ve MMCRI Hayvan Tesis Ek destek sağlanmıştır.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz | RS-4905 | 2 pairs required | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 578 001 | Wear mask | |
| Porcine Pancreatin | Sigma | P8096 | Wear mask | |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza | 17-513F | With Mg & Ca | |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | ||
| HBSS | Gibco | 14175 | ||
| KSFM | Gibco | 10724-011 | without added growth factors | |
| L-Glutamine 200mM | Sigma | G7513 | Use @ 1% v/v | |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma | P4333 | Use @ 1% v/v | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder | |
| 24 well culture plate | Thermo Scientific | 142485 | Nunclon | |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza | 17-512F | ||
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | ||
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml | |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Use @ 4 % w/v | |
| Triton X100 | VWR | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v | |
| PBS | Sigma | P3813 | Supplied as powder | |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v | |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 | |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 | |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
| Glycerol | EMD | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use “DNase on column” protocol | |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Falcon | 357575 |
References
- Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism. Development. 136, 3557-3566 (2009).
- Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution. Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).
- Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. Regulation of BMP7 expression during kidney development. Development. 125, 3473-3482 (1998).
- Grobstein, C. Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse. Science. 118, 52-55 (1953).
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172, 869-870 (1953).
- Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2. Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).
- Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population. Development. 131, 4593-4605 (2004).
- Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).
- Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129, 5301-5312 (2002).
