Aislamiento y cultivo de células de la zona nefrogénica del riñón de embriones de ratón
Summary
En este informe se describe un método para el aislamiento y la cultura de los nichos de células progenitoras de los riñones de embriones de ratón que pueden utilizarse para estudiar las vías de señalización que regulan células madre / progenitoras de los riñones en desarrollo. Estas células cultivadas son muy accesibles a pequeñas moléculas y tratamiento de proteínas recombinantes, y esto es importante también para la transducción viral, que permite la manipulación eficiente de las vías de candidato.
Abstract
El desarrollo embrionario del riñón ha sido ampliamente estudiado como un modelo para la interacción epitelio-mesénquima en la organogénesis y para ganar la comprensión de los orígenes de la enfermedad renal congénita. Más recientemente, la posibilidad de dirigir ingenuo células madre embrionarias hacia destinos nefrogénica ha sido explorada en el campo emergente de la medicina regenerativa. Los estudios genéticos en ratones han identificado varios caminos necesarios para el desarrollo del riñón, y un catálogo global de la transcripción de genes en el órgano ha sido recientemente generada http://www.gudmap.org/ , proporcionando numerosas candidato reguladores de las funciones esenciales del desarrollo. Organogénesis del riñón de roedores puede ser estudiado en cultivos de órganos, y muchos informes se ha utilizado este enfoque para analizar los resultados de la aplicación de cualquiera de las proteínas candidatas o derribar la expresión de genes candidatos mediante siRNA o morfolinos. Sin embargo, la aplicabilidad de la cultura de órganos para el estudio de la señalización que regula la madre / la diferenciación de células progenitoras en comparación con la renovación en el riñón en desarrollo es limitado, como órganos cultivados contienen una difusión compacta de la matriz extracelular limitación de las macromoléculas y las partículas de virus. Para el estudio de la señalización celular eventos que influyen en la madre / nicho de células progenitoras en el riñón, hemos desarrollado un sistema de célula primaria que establece la zona nefrogénica o nicho de células progenitoras de la ex vivo de riñón en desarrollo en el aislamiento del inductor de la diferenciación del epitelio. Utilizando digestión enzimática limitada, las células de la zona nefrogénica puede ser liberado de forma selectiva el desarrollo de los riñones en E17.5. Después de la filtración, estas células pueden ser cultivadas en una monocapa irregular con las condiciones más favorables. Análisis de marcadores de genes demuestra que estos cultivos contienen una distribución de los tipos celulares característicos de la zona nefrogénica en vivo, y que mantienen la expresión adecuada del gen marcador durante el período de cultivo. Estas células son muy accesibles a pequeñas moléculas y tratamiento de proteínas recombinantes, y esto es importante también para la transducción viral, lo que facilita enormemente el estudio de los candidatos madre / progenitoras efectos sobre las células del regulador. Parámetros básicos de biología celular como la proliferación y muerte celular, así como cambios en la expresión de marcadores moleculares característicos de la nefrona células madre / progenitoras in vivo puede ser utilizado con éxito como los resultados experimentales. Trabajo en curso en nuestro laboratorio con esta nueva técnica de células primarias tiene como objetivo descubrir los mecanismos básicos que rigen la regulación de la auto-renovación versus diferenciación en nefrona células madre / progenitoras.
Protocol
Discussion
En este protocolo se describe un método para aislar y cultivar células de la zona nefrogénica del riñón embrionario. Es el desarrollo de un método publicado inicialmente como parte de un estudio de los efectos de BMP7 tratamiento de las células de la zona nefrogénica (al blanco y otros., 2009). En el estudio inicial, una serie de experimentos para caracterizar los tipos de células representadas en la población NZC se llevaron a cabo. En pocas palabras, la purificación de NZCs de los periodis…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el R01 DK078161 de NIDDK (LO), becas postdoctorales de la American Heart Association (AB), la Fundación Wenner-Gren de Suecia y Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Suecia (UB). Apoyo adicional fue proporcionada por el Centro Médico de Maine instalaciones centrales del Instituto de Investigación para la histopatología, Bioinformática y FACS (apoyado por 2P20RR18789-06) y el Fondo para el Animal MMCRI.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz | RS-4905 | 2 pairs required | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 578 001 | Wear mask | |
| Porcine Pancreatin | Sigma | P8096 | Wear mask | |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza | 17-513F | With Mg & Ca | |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | ||
| HBSS | Gibco | 14175 | ||
| KSFM | Gibco | 10724-011 | without added growth factors | |
| L-Glutamine 200mM | Sigma | G7513 | Use @ 1% v/v | |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma | P4333 | Use @ 1% v/v | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder | |
| 24 well culture plate | Thermo Scientific | 142485 | Nunclon | |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza | 17-512F | ||
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | ||
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml | |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Use @ 4 % w/v | |
| Triton X100 | VWR | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v | |
| PBS | Sigma | P3813 | Supplied as powder | |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v | |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 | |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 | |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
| Glycerol | EMD | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use “DNase on column” protocol | |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Falcon | 357575 |
References
- Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism. Development. 136, 3557-3566 (2009).
- Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution. Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).
- Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. Regulation of BMP7 expression during kidney development. Development. 125, 3473-3482 (1998).
- Grobstein, C. Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse. Science. 118, 52-55 (1953).
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172, 869-870 (1953).
- Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2. Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).
- Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population. Development. 131, 4593-4605 (2004).
- Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).
- Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129, 5301-5312 (2002).
