El uso de sistemas de NanoDrop microvolumen como alternativa práctica y eficaz a la tradicional metodología de cuantificación de ácidos nucleicos se describe a través de la demostración de dos protocolos de ácido nucleico microvolumen cuantificación.
Ensayos biomoleculares se están desarrollando continuamente que el uso de cantidades cada vez más pequeños de material, que a menudo impide el uso de cubetas convencionales basados en instrumentos para la cuantificación de ácidos nucleicos para aquellos que pueden realizar la cuantificación microvolumen.
La muestra NanoDrop microvolumen sistema de retención (Thermo Científico Productos NanoDrop) funciona mediante la combinación de la tecnología de fibra óptica y las propiedades naturales de la tensión superficial para captar y retener pequeñas cantidades de muestra independiente de los aparatos de contención tradicionales, tales como cubetas o capilares. Además, el sistema cuenta con más cortos recorridos, que se traducen en un amplio rango de mediciones de concentración de ácido nucleico, básicamente eliminando la necesidad de realizar diluciones. Reducir el volumen de muestra necesario para el análisis espectroscópico también facilita la inclusión de nuevas medidas de control de calidad a lo largo de muchos flujos de trabajo molecular, incrementando la eficiencia y en última instancia conduce a una mayor confianza en los resultados posteriores.
La necesidad de un análisis de alta sensibilidad fluorescentes de masa limitada también ha surgido con los últimos avances experimentales. Utilizando la tecnología de retención que microvolumen muestra, las mediciones de fluorescencia se puede realizar con 2 l de material, lo que permite fluorescentes requisitos de volumen de ensayos se redujo significativamente. Microreactions como de 10 l o menos, ahora es posible con una dedicada fluorospectrometer microvolumen.
Dos nucleicos microvolumen protocolos de cuantificación de ácidos se demostró que el uso integrado de sistemas de retención de la muestra como una alternativa práctica a los tradicionales protocolos basados en la cubeta. En primer lugar, un método directo A260 absorbancia con un espectrofotómetro microvolumen se describe. Esto es seguido por una demostración de un método de fluorescencia basada en que permite reducir volumen de las reacciones de fluorescencia con un fluorospectrometer microvolumen. Estas nuevas técnicas permiten la evaluación de las concentraciones de ácido nucleico que van de 1 pg / mL a 15.000 ng / l con un consumo mínimo de la muestra.
Los protocolos de cuantificación que aquí se presenta se basa en la más aceptada sistemas microvolumen. Estos sistemas ofrecen alternativas prácticas para la tradicional metodología de cuantificación de ácidos nucleicos, que se basan en el volumen de la muestra mayor y el uso de aparatos de contención.
NanoDrop microvolumen tecnología emplea un sistema de retención de la muestra que se basa en las propiedades de tensión superficial de la muestra que se está midiendo para formar una columna de líquido. Es esencial que la muestra se pone en contacto con las superficies superior e inferior de medición óptico para la formación de la columna correcta. Si en algún momento los resultados de las mediciones parecen inexactos o no reproducible, lo más probable es el resultado de la heterogeneidad de la muestra o la rotura de columna de líquido.
Detergentes y el alcohol isopropílico no se recomiendan los agentes de limpieza, ya que pueden sin condiciones de las superficies de medición pedestal. Un pedestal incondicionada se produce cuando las propiedades de superficie hidrofóbica del pedestal se han comprometido, resultando en un aplanamiento de la gota de la muestra. Pedestales acondicionado puede conducir a la rotura de la columna de líquido durante la medición.
La superficie de la figura 3. Incondicionado se caracteriza por un aplanamiento de una gota de agua.
Superficies Uncondtioned pedestal pueden ser reacondicionadas con pedestal compuesto NanoDrop reacondicionamiento (PR-1, Thermo Scientific Productos NanoDrop). Una fina capa de compuesto de reacondicionamiento se aplica a las superficies superior e inferior del pedestal, se deja secar durante aproximadamente 30 segundos, y luego contagió con un paño limpio, seco y sin pelusa, un paño de laboratorio. Un estado con éxito reacondicionados se caracteriza por una gota de agua abalorios cuando se aplica a la superficie inferior del pedestal.
Figura 4. Una superficie reacondicionados se caracteriza por una partida de una gota de agua.
Sistemas de cuantificación microvolumen reducir en gran medida el consumo de la muestra y aumentar considerablemente el rango de concentración en comparación con los sistemas de cuantificación más tradicionales. Aunque la cuantificación microvolumen a menudo ha convertido en una tecnología que permite a circunstancias relacionadas con la masa de células limitados, tales como biopsias con aguja y microdisección láser de captura, la eficiencia y la facilidad de uso de esta metodología ha hecho que sea ampliamente aceptada alternativa a los métodos de cuantificación de ácidos nucleicos, incluso cuando la muestra es abundante.
The authors have nothing to disclose.
Richard W. Beringer y David L. Ash, científicos de aplicaciones, productos de Thermo NanoDrop Ciencia, para la asistencia técnica y la filmación.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | ||
NanoDrop 3300 | Thermo Fisher Scientific | ND-3300 |