Test clonogénique: cellules adhérentes
Summary
L'applicabilité du test clonogénique pour évaluer la viabilité de la reproduction a été mis en place depuis plus de 50 ans. Ici, nous démontrons la procédure générale pour réaliser le dosage clonogénique de cellules adhérentes.
Abstract
Le clonogénique (ou formant colonie) test a été mis en place depuis plus de 50 ans, le document original décrivant la technique a été publié en 1956 1. En dehors de la documentation du procédé, l'étude de référence initiale générée de la première courbe de réponse en rayonnement dose de rayons X irradiés mammifères (HeLa) des cellules en culture 1. Fondamentalement, le test clonogénique permet d'évaluer les différences de viabilité de reproduction (capacité des cellules à produire une descendance; c'est à dire une seule cellule pour former une colonie de 50 cellules ou plus) entre les cellules témoins non traitées et les cellules qui ont subi divers traitements tels que l'exposition aux rayonnements ionisants, divers composés chimiques (par exemple des agents cytotoxiques) ou dans d'autres cas de manipulation génétique. Le dosage est devenue la technique la plus largement acceptée en radiobiologie et a été largement utilisé pour évaluer la sensibilité aux rayonnements de différentes lignées cellulaires. En outre, le test clonogénique est couramment utilisé pour monitoring l'efficacité des composés rayonnement modification et pour déterminer les effets des agents cytotoxiques et d'autres thérapies anti-cancéreuses sur la capacité de formation de colonies, dans différentes lignées cellulaires. Une expérience de survie clonogénique typique utilisant des lignées de cellules adhérentes comporte trois composantes distinctes, 1) le traitement de la monocouche de cellules dans des flacons de culture tissulaire, 2) préparation des suspensions cellulaires simples et placage d'un nombre approprié de cellules dans des boîtes de Pétri et 3) fixation et coloration des colonies après une période d'incubation approprié, qui peut varier de 1-3 semaines, en fonction de la lignée cellulaire. Ici nous montrent le mode opératoire général pour la réalisation du test clonogénique avec des lignées de cellules adhérentes à l'aide d'une ligne cellulaire de kératinocytes humains immortalisés (FEP-1811) 2. En outre, nos objectifs sont de décrire les caractéristiques communes des essais clonogéniques y compris le calcul de l'efficacité d'étalement et des fractions de survie après exposition des cellules aux radiations, et d'illustrer la modification desrayonnement de réponse à l'utilisation d'une formulation anti-oxydant naturel.
Protocol
Discussion
Dans cet exemple, l'homme FEP-1811 kératinocytes ont été traitées avec différentes concentrations allant jusqu'à 100 mg / mL PCF; données sont présentées pour 20 pg / ml PCF pendant 1 heure à 37 ° C. Cellules de traitement suivants ont été irradiés avec 4 Gy en utilisant une source de 137 Cs (Gammacell 1000 irradiateur Elite; Nordion International, ON, Canada, 1,6 Gy / min). Pour le contrôle non traités et de drogues traitements à seulement 100 cellules ont été étalées dans chaque…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le soutien de l'Institut australien des sciences et génie nucléaires est reconnu. TCK a été récipiendaire du prix Ainse. Médecine de laboratoire épigénomique est soutenu par la National Health and Medical Research Council of Australia (566559). HR est pris en charge par un Australien d'études supérieures et des prix BakerIDI étincelles lumineuses. Ce travail est financé par le CRC d'Imagerie Biomédicale Development Ltd (CRC-BID), mis en place et soutenus dans le cadre de la recherche du gouvernement australien centres du programme de coopération. Le CO est le destinataire d'un australien d'études supérieures prix et une bourse supplémentaire CRC-BID.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI-Chem | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
