Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler
Summary
50 yıldan fazla üreme canlılığını değerlendirmek için clonogenic testin uygulanabilirliği için kurulmuştur. Burada yapışık hücrelere clonogenic tahlil yapmak için genel prosedür göstermektedir.
Abstract
Clonogenic (ya da koloni oluşturan) testinin, 50 yılı aşkın kurulmuştur; 1956 1 tekniğini anlatan orijinal kağıt yayımlandı. Yöntemini belgeleyen dışında, ilk dönüm noktası çalışma kültürü 1 X-ray ışınlanmış memeli (HeLa) hücreleri için ilk radyasyon doz yanıt eğrisi oluşturulur. Kontrolü tedavi edilmezse hücreleri ve bu tür maruz kalma gibi değişik işlemlerden geçirilmiş hücreleri arasında; Temelde, clonogenic testi üreme canlılığı farklılıkları (50 veya daha fazla hücre bir koloni oluşturmak için tek bir hücre yani döl hücreleri kapasitesi) bir değerlendirme sağlar radyasyon iyonize, çeşitli kimyasal bileşikler (örneğin sitotoksik ilaçlar) ya da diğer durumlarda genetik manipülasyon. Tahlil radyasyon biyolojisi en yaygın kabul gören bir tekniği haline gelmiştir ve farklı hücre hatları radyasyon duyarlılığı değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır olmuştur. Ayrıca, clonogenic testi yaygın radyasyon değiştirerek bileşiklerin etkinliğinin izlenmesi ve koloni oluşturan farklı hücre hatları yeteneği, sitotoksik ajanlar ve diğer anti-kanser tedavileri etkileri belirlemek için kullanılır. Yapışık hücrelere hatları ile tipik bir clonogenic hayatta kalma deney koloniler tespit ve boyama üç farklı bileşenleri, 1), doku kültürü şişeler, hücre monolayer tedavisi, 2) tek bir hücre süspansiyonlarının hazırlanması ve uygun bir hücre sayısı petri kaplarına ve 3 kaplama) içerir. ilgili bir kuluçka dönemi sonrası, hangi hücre hattı bağlı olarak, 1-3 hafta arasında olabilir. İşte biz, bir ölümsüzleştirdi insan keratinosit hücre hattı kullanımı (FEP-1811) 2 ile yapışık hücre hatları ile clonogenic tahlil yapmak için genel prosedürü göstermektedir . Ayrıca, bizim hedeflerimize hücreleri radyasyona maruz kaldıktan sonra kaplama verimliliği ve hayatta kalma fraksiyonları hesaplama da dahil olmak üzere clonogenic testlerinin ortak özelliklerini tanımlamak ve doğal bir antioksidan formülasyonu kullanımı ile radyasyon cevap modifikasyonu örneklemek için.
Protocol
Discussion
Bu örnekte, 100 mcg / ml CPF insan FEP-1811 keratinositler çeşitli konsantrasyonlarda ile tedavi edildi; veriler 37 1 saat için 20 mg / ml CPF ° C için gösterilen Ardından tedavi hücreleri 137 Cs kaynak (Nordion Uluslararası, ON, Kanada; 1.6 Gy / dk Gammacell 1000 Elite ışınlama) kullanılarak 4 Gy ışınlanmış. Tedavi edilmemiş ve ilaç tedavileri 100 hücre kontrolü için her bir petri kaplama ve çanak başına 1000 hücreleri ışınlanmış örnekler için kaplanmıştır. Yukarıdaki t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Avustralya Nükleer Bilimi ve Mühendisliği Enstitüsü destek kabul edilmektedir. TCK AINSE ödül layık görüldü. Epigenomic Tıp Laboratuarı, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (566.559) Avustralya tarafından desteklenmektedir. İK, Avustralya, mezuniyet sonrası ve BakerIDI parlak kıvılcım ödül tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, Biyomedikal Görüntüleme Geliştirme Ltd (CRC-BID), kurulan ve Avustralya Hükümeti Ortak Araştırma Merkezleri programı kapsamında desteklenen CRC tarafından finanse edilmektedir. CO Avustralyalı bir mezuniyet sonrası ödül ve CRC-BID ek burs almıştır.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI-Chem | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
