本协议描述了线粒体钙通量实时荧光成像测量方法。该方法采用一个基于循环permutated YFP的双激励比例的钙传感器选择性表达在线粒体(比例pericam吨)的优势。
在各种刺激的反应的细胞内钙离子浓度的动态变化调节许多细胞过程,如增殖,分化和凋亡1。在促进细胞凋亡,线粒体中钙积累从线粒体释放促凋亡因素, 进入细胞质2。因此,利益直接测量原位活细胞线粒体钙在细胞凋亡过程中。高分辨率荧光成像与双激励的比例和非比例合成钙染料加载细胞已被证明是一个可靠和灵活的工具来研究细胞内钙信号的各个方面。测量胞浆钙通量,使用这些技术相对比较简单。然而,测量使用rhod – 2和rhod – FF如合成钙指标的完整细胞intramitochondrial的钙离子水平,是更具挑战性。有针对性的线粒体合成的指标有减弱的反应在线粒体钙重复增加,破坏线粒体形态 3 。此外,综合指标往往超过几个小时,这使得它们不适合用于长期实验泄漏线粒体。因此,根据基于绿色荧光蛋白(GFP)4或有针对性的线粒体aequorin 5的基因编码的钙指标大大促进线粒体钙的动态测量。在这里,我们描述了一个简单的方法线粒体钙通量实时测量在不同的刺激的反应。该方法是基于“比例pericam',这是选择性地针对线粒体的荧光显微镜。比率pericam是一种钙指标的基础上,融合的循环置换的黄色荧光蛋白和钙调蛋白4。钙的比例pericam结合导致其激发峰从415纳米到494纳米的转变,而发射光谱,其中峰515纳米左右,保持不变。成比例pericam绑定一个单一的钙离子的解离常数在体外〜1.7 微米 4 。比例pericam这些属性允许线粒体钙离子浓度的快速和长期的变化进行量化。此外,我们描述了这种方法的适应,以一个标准的宽视场的钙成像显微镜用普通的过滤器设置。使用两种不同的受体激动剂,嘌呤受体激动剂ATP和凋亡诱导药物星形孢菌素,我们展示了几秒钟到几小时的时间分辨率监测线粒体钙离子浓度的变化,这种方法是适当的。此外,我们还证明,比例pericam也是用于测量/细胞凋亡过程中线粒体裂变碎片。因此,pericam比例是特别适合长期连续的细胞凋亡过程中线粒体钙的动态测量。
在这里,我们提出了一个非常简单的方法测量线粒体钙线粒体有针对性的比例pericam。如图1a所示,使用标准广角光学没有去卷积,它可以轻松地查看个人线粒体在HeLa细胞中可以接受的信号噪声比。这是因为HeLa细胞,如文化中的大多数细胞,扁平化,大大壁时无须共聚焦显微镜或其他专用设备的需要。我们坚持多聚赖氨酸涂层的盖玻片的Jurkat细胞中发现了类似的结果。对比方法,使用的染料,它也有可能使用比例pericam(图1E),如基因编码的钙指标的小时线粒体钙的水平,非侵入性的监测。分析线粒体钙在细胞死亡时,这一点尤为重要。此外,它也可以可视化在细胞凋亡过程中线粒体的裂变/碎片。如在图1D和E所示,星形孢菌素治疗增长缓慢导致线粒体该峰的选择亚群在20分钟中的钙。钙水平下降,在治疗2小时后再次前再次与线粒体碎片伴随。这是与星形孢菌素测量治疗使用FURA – 2 9诱导的胞浆钙的慢波相一致。因此,这是不符合聘用静态测量的方法,可以得到重要的动力学信息。虽然我们提出的比率和图1中的钙离子浓度,它是可以就地校准的传感器来计算绝对钙的水平 , 10。一个重要的需要考虑的是,比例pericam敏感,pH 值4,10 。由于胞质和线粒体pH值可以改变11细胞凋亡过程中显着,这是一个重要的考虑因素。在孤立的线粒体表达pericam中的pH值滴定表明 ,[H +]的增加排放的pericam兴奋时在495 nm的激发在410 nm,已利用的一个属性,同时测量两个线粒体钙的受激发射的影响不大, pH值12。因此,有选择性地监测与410 nm激发的排放提供了一种非ratiometrically显示器线粒体钙与pH值的降低关注。最后,这里介绍的协议,只需要访问一个广泛使用的过滤器的标准啶显微镜,从而使这项技术访问大多数实验室。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢为我们提供的比例,pericam MT的表达构建宫胁淳。这项工作是支持的美国国立卫生研究院(DB)的赠款GM081685。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. | |
Imaging Software | Molecular Devices, Inc | Metafluor | ||
Attofluor cell chamber | Invitrogen Corporation | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen Corporation | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies | |
MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen Corporation | M7512 |