निगरानी Apoptosis के दौरान Mitochondrial कैल्शियम स्तर में गतिशील परिवर्तन एक आनुवंशिक एन्कोडेड कैल्शियम सेंसर का उपयोग
Summary
इस प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा वास्तविक समय mitochondrial कैल्शियम अपशिष्टों की माप के लिए एक विधि का वर्णन करता है. विधि एक circularly permutated YFP आधारित दोहरे उत्तेजना ratiometric कैल्शियम (ratiometric pericam – लाख टन) सेंसर चुनिंदा mitochondria में व्यक्त का लाभ लेता है.
Abstract
Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of ‘ratiometric-pericam’ which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 μM4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.
Protocol
Discussion
यहाँ हम mitochondrial – लक्षित ratiometric pericam का उपयोग कर mitochondrial कैल्शियम को मापने के लिए एक बहुत ही सरल विधि प्रस्तुत करते हैं. जैसा कि चित्र 1A में दिखाया गया है, कोई deconvolution के साथ मानक widefield प्रकाशिकी का उपयोग यह संभव है करने के लिए आसानी से HELA कोशिकाओं में स्वीकार्य संकेत से शोर अनुपात के साथ अलग – अलग mitochondria देखने. यह है क्योंकि HELA कोशिकाओं, संस्कृति में सबसे अधिक कोशिकाओं की तरह, बाहर काफी समतल जब पक्षपाती confocal माइक्रोस्कोपी या अन्य विशेष उपकरणों के लिए की जरूरत है obviating. हम Jurkat कोशिकाओं पाली lysine लेपित 8 coverslips पालन में इसी तरह के परिणाम मिल गया है. रंगों का उपयोग के तरीके के विपरीत, यह भी संभव है के लिए गैर invasively आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ratiometric pericam (चित्रा 1E) के रूप में कैल्शियम संकेतकों का उपयोग घंटे के लिए mitochondrial कैल्शियम का स्तर की निगरानी. यह खासकर तब महत्वपूर्ण है जब कोशिका मृत्यु के दौरान mitochondrial कैल्शियम का विश्लेषण. इसके अलावा, यह भी संभव है apoptotic प्रक्रिया के दौरान विखंडन / mitochondria के विखंडन कल्पना. के रूप में आंकड़े 1D और ई में दिखाया गया है, staurosporine उपचार 20 मिनट में mitochondria जो चोटियों का चयन subpopulations में कैल्शियम में धीमी वृद्धि का कारण बनता है. कैल्शियम का स्तर नीचे जाने के उपचार के बाद 2 घंटे के फिर से जाने से पहले फिर से mitochondrial विखंडन के साथ सहवर्ती. यह staurosporine मापा उपचार Fura – 9 2 उपयोग से प्रेरित साइटोसोलिक कैल्शियम में धीमी गति से लहरों के साथ संगत है . इस प्रकार, महत्वपूर्ण गतिज जानकारी प्राप्त हो सकता है जो स्थिर माप रोजगार के तरीकों के साथ संभव नहीं है सकते हैं. हालांकि हम अनुपात और चित्रा 1 में नहीं सांद्रता कैल्शियम प्रस्तुत किया है, यह संभव है कि बगल में सेंसर जांचना निरपेक्ष कैल्शियम स्तर 4, 10 की गणना . पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण चेतावनी है कि ratiometric pericam पीएच 4, 10 संवेदनशील है. के रूप में दोनों साइटोसोलिक और mitochondrial पीएच स्तर को नाटकीय रूप से 11 apoptosis दौरान बदल सकते हैं, यह एक महत्वपूर्ण विचार है. पृथक mitochondria व्यक्त pericam में पीएच के अनुमापन दिखाना है कि बढ़ती [H +] pericam के उत्सर्जन बढ़ता है जब 495 एनएम पर 410 एनएम पर उत्तेजना, जो शोषण किया गया है एक संपत्ति के लिए एक साथ दोनों mitochondrial कैल्शियम को मापने के द्वारा प्रेरित उत्सर्जन पर थोड़ा प्रभाव के साथ , उत्साहित और 12 पीएच. इस प्रकार, चुनिंदा 410 एनएम उत्तेजना के साथ उत्सर्जन निगरानी पीएच के लिए कम चिंता के साथ गैर ratiometrically मॉनिटर mitochondrial कैल्शियम के लिए एक साधन प्रदान करता है. अंत में, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल केवल व्यापक रूप से उपलब्ध फिल्टर के साथ एक मानक epifluorescent खुर्दबीन उपयोग की आवश्यकता है, इस प्रकार इस तकनीक का सबसे प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बना.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Atsushi Miyawaki हमें अभिव्यक्ति ratiometric pericam – मीट्रिक टन के निर्माण के साथ प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (DB) से यह काम GM081685 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. | |
| Imaging Software | Molecular Devices, Inc | Metafluor | ||
| Attofluor cell chamber | Invitrogen Corporation | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Corporation | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies | |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen Corporation | M7512 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Hajnoczky, G. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Miyawaki, A. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Shimozono, S. Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein. Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).
- Wozniak, A. L. Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis. J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).
- Boehning, D. Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).
- Csordas, G. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
- Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
