Summary

离体骨骼肌肌的力学分析

Published: February 22, 2011
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Summary

为了评估<em>在体内</em>肌肉疾病的治疗性干预的影响,方法是需要定量力量的产生和治疗肌肉疲劳性。我们详细评估explanted小鼠后肢肌肉的肌力学性能的方法。这种分析提供了一个强大的方法,以定量的影响肌肉功能的基因改造,以及在治疗肌肉疾病的小鼠模型的比较。

Abstract

在体内治疗肌肉疾病1,2,3的治疗干预的影响评估,定量分析方法,测量力的产生和治疗肌肉疲劳性。我们描述了一个新鲜explanted从小鼠后肢肌肉中的肌机械性能评估的详细方法。我们描述了小鼠趾长伸肌肌肉的非创伤性的收获,安装的肌肉,在肌肉地带肌动描记器(型号820MS;丹麦MYO技术)和最大抽搐,强直张力,收缩时间,半弛豫时间的测量,使用方波脉冲刺激器(型号S48;草技术)。使用这些测量,我们展示了具体的抽搐和规范化肌肉的横截面积,抽搐,强直紧张的比例,力-频率关系曲线和低频疲劳曲线 4强直张力的计算。这种分析方法提供了一个为1,2,3,5肌肉疾病的小鼠模型,以及治疗干预的肌肉功能的基因改造6,7,8,9影响比较之间的定量比较。

Protocol

加州大学旧金山分校的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准该协议。 1。鼠标趾长伸肌 (EDL)肌肉的解剖按照机构准则执行的所有动物的程序。 安乐死与200 mg / kg腹腔巴比妥/颈椎脱位,肌肉收获10前的动物。剥离应实行,使肌肉可收获和“安乐死”的15分钟内,安装在张力换能器。 夹层纸盒和引脚腿到托盘上排列胴体仰卧。 在解剖镜下,开放的皮肤,小心地打开筋膜(图1a),和剥离胫骨从脚踝向上暴露的EDL(图1b) 。使用滴乳酸林格氏液,以保持肌肉湿润和收获期间的缓冲。 删除的EDL,保留尽可能多的肌腱上,每年年底,并把到一个Petri菜含有乳酸林格氏液。铁缝合肌腱( 图1c)。重要的是,肌纤维不能触及,或在清扫不安。 2。鼠标EDL的安装在肌肉地带肌动描记对于这些研究中,一个组织洗澡是需要的,固定的肌肉,同时允许它在恒温沐浴在生理溶液中连续充氧。洗澡加上一个力传感器的测量肌肉紧张。我们采用从丹麦MYO技术(DMT型号820MS)的综合肌肉地带肌动描记洗澡为此。此外,一个方形脉冲电刺激(草型号S48)和数据采集平台(ADInstruments PowerLab系统的数据采集系统和LabChart软件)引出,记录和分析MYO机械的反应,分别需要。大唐820MS集成到盒盖定位肌肉两侧肌肉地带中旬部分,铂电极。其他myographs可能需要特别注意电极放置。 肌动描记浴填写5毫升克雷布斯Henseleit解决方案11。加热至25 ° C。泡泡O 2 / CO 2(95%/ 5%),通过洗澡前15分钟使用。 使用缝线的EDL肌动描记夹具之间的延长和夹具之间的EDL肌筋(Fig.1D五 )安全。要小心不要夹肌肉本身。 肌动描记浴保持在25 ° C。 3。肌的力学分析 A.抽搐紧张在洗澡时设置的初始长度,以便有没有肌肉松弛。 确定通过调整电压,以获得最大的抽搐紧张的最大刺激(持续时间为0.5毫秒),然后设定在20%以上最大的刺激(实现超最大刺激)。在我们的研究,超最大的刺激,通常在40伏的输出实现。 验证从使用示波器的刺激输出。 确定最佳长度逐渐伸展的肌肉,直到没有抽搐的紧张局势进一步增加。 允许3分钟的肌肉平衡。 交付平方米超最大的刺激在最佳使用电子刺激S44草的长度(0.5毫秒),并记录输出。 记录:抽搐张力曲线(P T随时间; 图2A)。 B.破伤风紧张让肌肉休息3分钟。 应用最佳使用电子刺激S44草的长度在150赫兹的超最大刺激的列车为300毫秒,并记录输出。 记录:破伤风张力曲线(P O随时间; 图2B)。 C.部队频率让肌肉休息3分钟。 部队频率:适用于30,60,100,140和160赫兹的超最大刺激的列车,彼此之间的刺激(图3)休息3分钟。此外,火车可应用于15,25,35,45,55,65,75,100,140和160赫兹在较低的频率更高的分辨率,其中力变化显着。 剧情:力频率的关系(%最大力量与刺激频率)。 D.疲劳应用短破伤风的火车:300毫秒(或调整,以产生50%的峰值力的频率),每10分钟3秒60赫兹。 10分钟,强直力下降的一个〜15%的初始值( 图4)高原水平。 剧情:低频疲劳(%最大力量与时间)。 E.在协议结束额外的数据收集在卸载肌肉的肌动描记之前,设置MUSC乐在最佳长度确定的步骤III.A.4,使用显微镜或一个眼,用游标卡尺测量其直径。计算截面积(2微米)。 通过去除缝线,体重肌肉测量肌肉质量(毫克)。 称重鼠标评估体重(GM)。 4。计算肌肉:体重比= 肌肉质量/体质量抽搐紧张,P T(MN)= 在抽搐产生的最大张力具体抽搐张力(N /厘米2)= 抽搐张力(MN)/截面积(2微米)× 10 5 / MN•微米2 /厘米2 到峰值张力时间(毫秒)= 从收缩发病时间最大张力半弛豫时间(毫秒)= 从峰值紧张到峰值张力的50% 强直紧张,P O(MN)= 在破伤风产生的最大张力具体强直张力(N /厘米2)= 强直张力(MN)/截面积(2微米)× 10 5 / MN•微米2 /厘米2 破伤风上升最大速率(N / S)= 期间,破伤风,即紧张,强直张力曲线的最大斜率(或DP的O / DT)上升的紧张局势加剧的最高税率半松弛强直张力(MS)= 时间从停止刺激,在紧张刺激终止的50% 抽搐紧张强直张力比,P – T / P O = 最大抽搐张力/最大强直张力疲劳指数= 经过两分钟的低频疲劳等长张力最大的张力比 5。代表性的成果 图1。剖析的EDL肌肉。 EDL的一个 muscles.TA,后肢胫前,B,EDL(趾长伸肌)肌曝光,曝光C,EDL的肌腱缝合的附件,D,张力传感器浴(从侧面看),E,安装在洗澡(从上面)。在肌肉未完全沉浸在缓冲区,仅供;在实践中,应完全沉浸肌肉,防止干燥。 图2。张力曲线的例子 。 的抽搐紧张说明抽搐最大张力(P T),收缩时间(CT)和半弛豫时间(HRT)的曲线,例如酒吧,1秒,B,强直张力曲线显示最大强直张力(P O)的例子,半松弛强直张力(HRTT)。酒吧,1S。 图3。力频率的关系分析的例子 。 ,增量刺激频率产生的紧张局势,B,例如,在30MHz的脉冲序列。酒吧,80毫秒,C,例如,在140MHz的脉冲序列。酒吧,80毫秒,D,从A 中显示的数据派生的力-频率曲线的例子。力 – 频率曲线的形状是肌肉力量的特点,可以比较来自不同动物的肌肉之间。 图4。低频疲劳分析的例子 。超过stimulation.Examples在指定的时间点(B,C,D)的低频脉冲串期间产生了递减的紧张局势图所示,E,从 A中显示的数据产生的低频疲劳曲线的范例。低频疲劳曲线的形状是肌肉力量的特点,可以比较来自不同动物的肌肉之间。

Discussion

我们描述了一个详细的评估,在explanted从小鼠后肢肌肉的肌机械性能的方法。 EDL的,而更难以解剖,因为其背后的胫前肌后的位置,比胫前,因为其突出的腱附件的脚踝和膝盖关节更容易评估。这些筋便于安装在肌肉地带肌动描记。相反,更容易访问的胫前在膝关节广泛,几乎atendinous附件,异常艰难的两个剖析不影响肌肉的前提下,并安装在肌动描记安全。我们还指出,迅速安装在生理缓冲液和温度中的含氧浴肌肉,保持肌肉的力学性能是必不可少的。我们发现,我们可以长达30分钟重复这种分析没有显着变化,在这种条件下肌肉反应。最后,它是必不可少的,肌纤维不被感动在解剖和安装程序,可以有肌肉功能上的不利影响,并导致低估肌机械力。遵循这些程序,这种分析提供了可靠的定量方法来评估的肌肉功能的基因改造6,7,8,9影响,以及在肌肉疾病小鼠模型1,2,3,5治疗性干预之间的比较。

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作是支持公共卫生服务津贴(HL086513)从NHLBI私立教育机构,以及来自加州再生医学(RC1 – 00104),公共卫生服务津贴(HL085377)从NHLBI研究所的综合研究资助和礼品波林基金会HSB

资深大律师是一个加州再生医学的桥梁研究所的支持干细胞研究奖(TB1 – 01194)旧金山州立大学。

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
5-0 silk sutures   Oasis MV682 General surgery
Dupont #5 forceps   WPI 500233 General surgery
Hemostat, straight   WPI 501241 General surgery
Iris forceps   WPI 15914 General surgery
Lab Chart software   ADInstruments Version 7 Data analysis
Muscle Strip Myograph   DMT 820MS Tension transduction
Operating scissors   WPI 501754 General surgery
Oscilloscope   EZ OS-5020 Tension stimulation
Pentobarbital, sodium salt   Sigma P3761 Euthanasia
PowerLab   ADInstruments 8/30 Data acquisition
Square Pulse Stimulator   Grass Tech. S48 Tension stimulation
Vannas spring scissors   WPI 14003 General surgery

Solutions and Media

Lactated Ringer’s solution

  • 100 mM NaCl
  • 30 mM CH3CH(OH)COONa (sodium lactate)
  • 4 mM KCl
  • 1 mM CaCl2 2H2O (calcium chloride dihydrate)
    • adjust pH to 6.75

Krebs Henseleit solution

  • 118 mM NaCl
  • 4.7 mM KCl
  • 1.25 mM CaCl2
  • 1.2 mM MgCl2
  • 1.2 mM KH2PO4
  • 25 mM NaHCO3
  • 11 mM glucose
    • adjust pH to 7.2-7.4 by equilibrating with O2/CO2 (95%/5%) gas

Pentobarbital

  • 5 mg/ mL working solution in sterile water

References

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Citer Cet Article
Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (48), e2582, doi:10.3791/2582 (2011).

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