Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

Summary

In diesem Protokoll, Genexpression in Hefe (<em> Saccharomyces cerevisiae</em>) Geändert wird nach der Exposition gegenüber oxidativem Stress durch die Zugabe von Wasserstoffperoxid (H induzierte₂ O₂), Ein Oxidationsmittel.

Abstract

In diesem Protokoll wird die Genexpression in Hefe (Saccharomyces cerevisiae) verändert nach Exposition mit oxidativem Stress durch die Zugabe von Wasserstoffperoxid (H ₂ O _2), ein Oxidationsmittel induziert. Im Experiment wird Hefe für 48 Stunden in 1/2X YPD Brühe mit 3X Glukose gewachsen. Die Kultur wird in eine Kontroll-und behandelten Gruppe aufgeteilt. Das Experiment Kultur mit 0,5 mM H ₂ O ₂ in Hanks behandelt Kochsalzlösung (HBSS) für 1 Stunde. Die Kontroll-Kultur mit HBSS nur behandelt. Gesamt-RNA wird aus beiden Kulturen extrahiert und mit einem Biotin-markierten cRNA Produkt durch ein mehrstufiger Prozess umgewandelt. Die endgültige Synthese Produkt wieder auf die UVM Microarray Core Facility genommen und hybridisiert, die Affymetrix Hefe GeneChips. Die daraus resultierende Genexpression Daten werden in der Bioinformatik Datenanalyse-Software hochgeladen.

Protocol

<p class="jove_title"> 1 ist. Isolierung von Gesamt-RNA aus<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Mit enzymatischer Lyse</p><ol><li> Bereiten Sie ein RNase-freies Arbeiten Zone mit RNase ZAP (Ambion).</li><li> Bereiten Sie frische Arbeitskopie Lyticase Reagenz durch Zugabe von 1 ml RNase-freies Wasser direkt auf die Lyticase Fläschchen in eine finale Arbeitsdatei Lösung von 10 U / ul machen. Vortex gut und invertieren mehrmals vollständige Durchmischung zu gewährleisten. Diese 10 Einheiten / ul Lösung wird für 12 Stunden stabil.</li><li> Bereiten Sie frische DNase I-Lösung unter Verwendung des Qiagen DNase-Kit und speichere sie auf Eis.</li><li> Label ein 1,7 ml Reaktionsgefäß mit Ihrer Kennung. Übertragen 1,5 ml des geeigneten Hefekultur in die Röhre.</li><li> Centrifuge das Rohr bei 5000 xg (ca. 3 / 4 full speed) für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand (ohne störende Pellet) mit einer Mikropipette und den Überstand verwerfen.<strong>**** Wiederholen Sie Schritt 4, wenn Pellet zu klein ist oder wenn durch Ausbilder angegeben .****</strong</li><li> Add 1000 ul DEPC-Wasser auf die Pellet-, Wirbel-und Zentrifuge bei 5000 xg für 2 Minuten. Überstand verwerfen. Entfernen Sie so viel von der Flüssigkeit wie möglich aus der Hefe Pellet.</li><li> Fügen Sie die folgenden, die Hefepellet und Wirbel zu mischen.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> SGbuffer</td><td> 10 ul</td></tr><tr><td> Lyticasesolution (10u/μl)</td><td> 30 ul</td></tr></tbody></table</li><li> 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li><li> Vorsichtig schwenken die Röhre alle 10 Minuten, um Sphäroplasten generieren. Sphäroplasten müssen vorsichtig gehandhabt werden. Untersuchen Hefe unter dem Mikroskop zu kompletten Spheroplasting beobachten. Bei der Untersuchung der Hefe auf dem Objektträger, eine kleine Menge von 0,1% SDS, um die Hefe führen zu schwellen und bilden perfekte Kugeln (auch für angehende Zellen). Dies deutet darauf hin, dass die Zellwände wurden verdaut.</li><li> Add 350 ul b-RLT-Puffer, um das Rohr und Wirbel<strong> Kräftig</strong> 1 Minute. Stellen Sie sicher, Rohr dicht ist, indem der Deckel verschlossen geschlossen, während Vortexen. Dieses Verfahren wird lysieren die Sphäroplasten.</li><li> Add 250 ul 100% Ethanol auf die Tube und kurz vortexen. Ein Niederschlag kann nach der Zugabe von Ethanol zu bilden, aber dies wird keine Auswirkungen auf die Sammlung von RNA.</li><li<strong> Sammeln der RNA:</strong> Label eine RNeasy Spin-Säule mit Ihrer Identifikation informationand sorgfältig Übertragung aller von der Lösung aus Schritt 10 an den Spin-Säule mit einer Mikropipette. Achten Sie darauf, nicht auf die Silica-Membran mit der Pipettenspitze berühren. Schließen Sie die Tube und zentrifugieren Sie für 15 Sekunden bei voller Geschwindigkeit. Die RNA in der Probe wird auf die Silica-Membran der Spin-Säule haften.</li><li> Nehmen Sie die Spin-Säule aus der Sammlung Rohr. Pipet den Pass durch Flüssigkeit (die Flüssigkeit in das Sammelrohr) wieder auf den Spin-Säule und zentrifugieren wieder. Entsorgen Sie die Collection-Tube (mit der Strömung durch Flüssigkeit) und platzieren Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammel-Tube.</li><li> Add 350 ul RW1 Puffer in die Spin-Säule. Diese Lösung wird verwendet, um die RNA zu waschen und zu entfernen Salze und gelöste Zelltrümmer. Schließen Sie die Tube und zentrifugieren Sie für 15 Sekunden bei voller Geschwindigkeit.</li><li<strong> Verdauen der DNA:</strong> Nehmen Sie die Spin-Säule aus der Zentrifuge, öffnen Sie das Rohr Deckel und fügen Sie 80 ul DNase I-Lösung auf der Mitte der Spin-Säule Membran. Dieser Schritt wird jede gDNA in der Probe zu verdauen. Schließen Sie die Spalte Deckel und Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 Minuten.</li><li> Transfer der Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammel-Tube.</li><li<strong> Reinigen und Waschen der RNA:</strong> Add 350 ul RW1 Puffer in die Spin-Säule und zentrifugieren bei voller Geschwindigkeit für 15 Sekunden.</li><li> Löschen Sie den Deckel ab und legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammel-Tube.</li><li> 500 ul RPE Puffer, um die Spin-Säule, um die RNA auf die Silica-Membran zu waschen. Schließen Sie die Tube und zentrifugieren Sie für 15 Sekunden bei voller Geschwindigkeit<em>.</em</li><li> Löschen Sie den Deckel ab und legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammel-Tube.</li><li> Waschen Sie die Silica-Membran wieder durch das Hinzufügen eines weiteren 500 ul RPE Puffer, um die Spin-Säule. Schließen Sie die Tube und zentrifugieren Sie für 15 Sekunden bei voller Geschwindigkeit.</li><li> Setzen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammel-Tube und zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge bei voller Geschwindigkeit für 1 Minute, um sicherzustellen, restliche Flüssigkeit aus der Silica-Membran entfernt wird.</li><li<strong> Wiederherstellen des RNA:</strong> Übertragen Sie die RNeasy spin column, um eine neue 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die mit Ihrer Probe Informationen markiert worden ist. Beachten Sie, dass die Kappe des neuen Rohres nach links öffnet sich für die nächsten Schritte.</li><li> Vorsichtig pipet 30 mu l RNase-freies Wasser<strong> Direkt auf die Mitte</strong> Der Silica-Membran.<strong> Berühren Sie nicht die Silica-Membran mit der Pipettenspitze (siehe Diagramm)</strong>. Schauen Sie genau hin, wie Sie diesen Schritt ausführen. Benutzen Sie beide Hände, um die Pipette zu führen. Vergewissern Sie sich, das Wasser gleichmäßig auf der Membran verteilt.</li><li> Inkubieren Sie die Spin-Säule bei Raumtemperatur für 1 Minute. Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit für 30 Sekunden.</li><li> Vorsichtig Transfer der 30 ul, dass in den 1,7-ml-Tube gewonnen wird wieder auf die Mitte der Silica-Membran aus dem gleichen Spin-Säule wie in Schritt 22 oben. Legen Sie die Spalte wieder in den gleichen 1,7 ml Sammel-Tube und Inkubation für 1 Minute bei Raumtemperatur. Säule für 1 Minute bei voller Geschwindigkeit. Diese Doppel-Elution wird sichergestellt, dass die maximale Menge an RNA von der Membran gewonnen wird.</li><li> Label zwei neue 1,7 ml Reaktionsgefäßen mit Ihrer Identifikation Information und die Übergabe aller erholt RNA-Probe, um eine dieser Röhren.</li><li> Transfer 4 ul dieser Probe auf die anderen markierten Röhre. In diesem Beispiel wird wieder auf UVM transportiert werden für Nanodrop Quantifizierung und RNA qualitative Beurteilung (Dies ist die RNA quantitative und qualitative Analyse vor Ort bei den teilnehmenden Instituts durchgeführt zu validieren).</li><li> Legen Sie alle Proben auf Eis.</li><li<strong> RNA Quantifizierung:</strong> Mit dem BioPhotometer, die Absorption der RNA-Probe auf dem Spektralphotometer bei einer Verdünnung von 1 bis 50 (1μl Probe + 49μl H₂ O).</li><li> Bewerten Sie die RNA-Qualität mit dem E-Gel (Invitrogen) 1,2% vorgefertigten Agarosegel für die Elektrophorese.</li><li<strong> RNA Qualitative Analyse:</strong> Die E-Gel-Elektrophorese-Apparatur Set. Pre-run das Gel für 2 Minuten nach dem Verfahren des Herstellers. Nach dem Vorlauf, entfernen Sie das Gel Kamm und geben Sie 14 ul Wasser in jede Vertiefung von 1μl jeder Probe in jede Vertiefung folgen. Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren. Verwenden Sie eine geeignete Größe DNA Ladder in einem gut zum Größenvergleich später (BioLine Einfache Ladder I Größe Standard oder Novagen PCR-Marker). Notieren Sie, welche Probe wird in jeder Spur. Führen Sie das Gel für 20 Minuten.</li><li> Nehmen Sie ein Foto des Gels.</li></ol><p class="jove_title"> 2. First Strand cDNA Synthesis</p><ol><li> Label ein 0,5 ml PCR-Röhrchen mit Ihrer Kennung. Von der Konzentration der RNA aus dem obigen Experiment bestimmt, Berechnung des Volumens der Probe auf 3,0 ug erhalten. Übertragung dieser Betrag auf das Rohr. Fügen Sie genug RNase-freiem Wasser auf das Volumen auf 11,0 ul bringen.</li><li> Geben Sie 1.0 ul T7 Oligo (dT)₂₄ Reagenz auf das Rohr. Vergewissern Sie sich, besonderes Augenmerk auf die Pipettenspitze Volumen zahlen bei diesem Schritt um sicherzustellen, dass alle Reagenzien übertragen wurde. Vortex das Röhrchen und zentrifugieren bei voller Geschwindigkeit für 5 Sekunden. Das Röhrchen wird in einem Thermocycler auf 70 ° C für 10 Minuten.</li><li> Während die 70 ° C Inkubation im Gange ist, bereiten Sie das erste Strang Master-Mix in ein neues Röhrchen. Achten Sie darauf, die folgenden Reagenzien hinzufügen<strong> In Ordnung,</strong> Wirbel und Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit für 5 Sekunden und setzen Sie den Schlauch auf dem Eis.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> Erster Strang Master-Mix:</strong</td></tr><tr><td> FirstStrandBuffer5X</td><td> 4 ul</td></tr><tr><td> 0.1MDTT</td><td> 2 ul</td></tr><tr><td> 10mMdNTP</td><td> 1 ul</td></tr><tr><td> SuperscriptII</td><td> 1 ul</td></tr></tbody></table<br> Verwenden Sie eine P2 Mikropipette zu einem Volumen von 2 ul oder weniger messen.</li><li> Nach dem 70 ° C Inkubation in Schritt 2 abgeschlossen ist, fügen Sie 8 ul des ersten Stranges Master-Mix in Schritt 3, um das Rohr und inkubieren in einem Thermocycler bei 42 ° C für 60 Minuten. Wenn Erststrangsynthese Inkubation beendet ist, legen Sie den Schlauch auf dem Eis. Während dieser Inkubation Vorbereitung des zweiten Stranges Master-Mix.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Zweite cDNA-Synthese</p><ol><li> Nehmen Sie die folgenden zweiten Strang Master-Mix in ein neues Röhrchen. Halten Sie es auf Eis. Vortex und Zentrifuge alle Reagenzien vor dem Gebrauch. Fügen Sie die Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> Zweiter Aktionsbereich Master-Mix</strong</td></tr><tr><td> DEPC Wasser</td><td> 91 ul</td></tr><tr><td> 5X Zweiten Strand Buffer</td><td> 30 ul</td></tr><tr><td> DNTPs (10 mM)</td><td> 3 ul</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> DNA Ligase (10U/ul)</td><td> 1 ul</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> DNA-Polymerase I (10U/ul)</td><td> 4 ul</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> RNase H (2U/ul)</td><td> 1 ul</td></tr></tbody></table</li><li> Vortex das Röhrchen und zentrifugieren Sie für 5 Sekunden bei voller Geschwindigkeit.</li><li> Wenn die 42 ° C Inkubation beendet ist, übertragen alle 130 ul des zweiten Stranges Master-Mix, um die Probe Röhrchen mit der RNA-und Erst-Strang-Reagenzien. Vortex und zentrifugieren Sie für 5 Sekunden bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Röhrchen für 2 Stunden bei 16 ° C in einem Thermocycler.</li><li> Am Ende der 2 Stunden Inkubation und während der Probe ist noch bei 16 ° C, fügen 2μl T4-DNA-Polymerase-Reagenz auf die Tube. Kurz vortexen und zentrifugieren die Röhre und Inkubieren bei 16 ° C für nicht mehr als 5 zusätzliche Minuten. Inkubation länger als 5 Minuten können die Qualität der cDNA durch die 3'to 5'exonuclease Aktivität der T4-Polymerase.</li><li> Am Ende der 5 Minuten Inkubation werden 10 ul 0,5 M EDTA, die T4-DNA-Polymerase Reaktion zu stoppen. Bewahren Sie die Röhrchen bei -20 ° C.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Fällung der cDNA</p><ol><li> Centrifuge eine Phase Lock Gel Tube mit voller Geschwindigkeit für eine Minute, um sicherzustellen, wird das Gel am Boden der Röhre.<strong> NICHT VORTEX PHASE LOCK TUBES</strong>.</li><li> Add 162 ul des<strong> Untere Schicht</strong> Aus dem pH 8,0-Tris buffered Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (PCI), um den Inhalt des zweiten cDNA-Synthese Reaktionsrohres und Vortex für 5 Sekunden, um den Inhalt (Das Gesamtvolumen der cDNA-Synthese Schritt aus dem obigen Experiment Mix ist 162 ul. Die PCI Schritt erfordert gleiche Volumina wässriger und organischer Gemische).</li><li> Transfer aller cDNA-PCI-Gemisch, um die Phase Lock Gel Tube mit einer Mikropipette.<strong> NICHT VORTEX</strong> Die Phase Lock Gel Tube.</li><li> Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit für 2 Minuten.</li><li> Label einen neuen 1,7 ml Reaktionsgefäß. Verwenden Sie eine Mikropipette auf die oberste Schicht aus dem Phase-Lock-Gel-Tube auf die neu beschriftet 1,7 ml Röhrchen füllen. Versuchen Sie, so viel von der Schicht wie möglich zu sammeln.</li><li> Fügen Sie Folgendes zu den 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen und vortexen.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> Ethanol (100%)</td><td> 405 ul</td></tr><tr><td> NH₄ OAc</td><td> 80 ul</td></tr><tr><td> Pellet Paint-</td><td> 1 ul</td></tr></tbody></table</li><li> Das Röhrchen wird in die Zentrifuge mit dem Scharnier des Rohres nach außen und Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit für 20 Minuten bei Raumtemperatur.</li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Rohr aus der Zentrifuge zu achten, dass die cDNA Pellet stören. Das Pellet sollte rosa und etwa die Größe von einem Körnchen Salz und auf der Seite der Röhre unter dem Scharnier. Auf Eis stellen und sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Reinigung der cDNA Pellet</p><ol><li> Mit einem P1000 Mikropipette, entfernen Sie vorsichtig alle aus dem Glas. Achten Sie darauf, das Pellet stören. Denken Sie daran, dass das Pellet Ihre Probe!</li><li> Add 500μl kaltem 80% igem Ethanol (gelagert bei -20^° C Tiefkühler) mit dem Rohr. Gently Kappe der Röhre und drehen es langsam mehrere Male. Schauen Sie sich Ihre Pellet sehr eng. Wenn das Pellet löst sich das Reagenzglas wieder in Rack und lassen Sie das Pellet am Boden absetzen. Alternativ können Sie das Rohr mit voller Geschwindigkeit Zentrifuge für 15 Sekunden, um das Pellet auf dem Boden der Röhre zurück.</li><li> Mit einem P1000 Mikropipette, entfernen Sie vorsichtig das Ethanol sehr vorsichtig, nicht das Pellet stören. Tipp der Röhre auf die Entfernung von so viel Flüssigkeit wie möglich zu ermöglichen.</li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2 und 3 mit einem neuen Aliquot von 80% Ethanol.</li><li> Schließlich entfernen Sie alle Ethanol möglich mit einem P1000 Mikropipette. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit voller Geschwindigkeit für 5 Sekunden und mit einem P20 Mikropipette, entfernen Sie die letzten paar Mikroliter Ethanol. Das Ziel ist, so viel Ethanol wie möglich, ohne das Pellet zu entfernen.</li><li> Legen Sie die offene Röhre in ein Rack oder Trocknen box für 10-20 Minuten, um das restliche Ethanol verdampfen. Das getrocknete Pellet geht leicht verloren, wenn es trocken ist. Becareful um das Rohr vorsichtig zu behandeln. Wenn Sie fertig sind, schließen Sie den Deckel. Visualisieren Sie die getrocknete Pellet zu bestätigen, es ist in der Röhre.</li><li> Das Pellet in 22 ul RNase-freiem Wasser und legen Sie den Schlauch auf dem Eis.</li></ol><p class="jove_title"> 6. InVitroTranscription (IVT)</p><ol><li> Die ENZO BioArray Kit enthält alle benötigten Reagenzien an Biotin markierten cRNA aus cDNA vorzubereiten.<br /> Ein Master mixfor die gesamte Klasse als follows.The Lehrer vorbereitet werden bereiten diese Mischung oder benennen jemand aus der Klasse. Dies muss in ein RNase-freies Gebiet erfolgen.<br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Amt / Probe</td><td> #-Beispiele</td><td> Total</td></tr><tr><td> Reagenz 1 [10x Reaktionspuffer]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagenz 2 [10x Biotinnucleotides]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagenz 3 [10x DTT]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagenz 4 [10x RNase Inhibitor]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagens 5 [20x T7-RNA-Polymerase]</td><td> 2μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gesamtvolumen</td><td> 18 ul</td><td></td><td></td></tr></tbody></table<br><strong> Hinweis:</strong> Bereiten Sie genügend Master-Mix für die Anzahl der Proben plus eins. Dies wird genug versichern zum Pipettieren Zwecke.</li><li> Label ein 0,5 ml PCR-Röhrchen. Kombinieren Sie die folgenden in der Röhre und Pipette nach oben und unten mehrmals zu mischen. Spin in einer Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit für 5 Sekunden, um alle Reagenzien auf den Boden der Röhre zu bekommen.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> CDNA-Gemisch</td><td> 22μl</td></tr><tr><td> Enzomastermix [fromabove]</td><td> 18μl</td></tr><tr><td> TotalVolume</td><td> 40 ul</td></tr></tbody></table</li><li> Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C Seit 16 Stunden in der Thermocycler. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, speichern Sie die Probe bei -20 ° C</li></ol><p class="jove_title"> 7. Reinigung der biotinylierten cRNA</p><ol><li> Transfer der gesamten cRNA Probe, um eine neue 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Add 60 ul RNase-freies Wasser und 350 ul RLT-Puffer und Vortex für 5 Sekunden.</li><li> Add 250 ul 100% Ethanol und Wirbel wieder.</li><li> Label eine RNeasy Spin-Säule und den Transfer der gesamten cRNA Probe auf die Säule. Achten Sie darauf, die Spitze der Pipette an die Silica-Membran zu berühren. Schließen Sie den Deckel und zentrifugieren Sie für 15 Sekunden bei voller Geschwindigkeit.</li><li> Nehmen Sie die Spin-Säule aus der Sammlung Rohr. Pipet den Pass durch Flüssigkeit (die Flüssigkeit in das Sammelrohr) wieder auf den Spin-Säule und zentrifugieren wieder für 15 Sekunden.</li><li> Setzen Sie die Spin-Säule in ein neues 2-ml-und Pipette 500 ul der RPE-Puffer auf die Spin-Säule. Schließen Sie die Tube und zentrifugieren Sie für 15 Sekunden bei voller Geschwindigkeit. Discard Sammlung Rohr und dem Durchlauf durch Flüssigkeit. Legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammel-Tube.</li><li> Add another 500 ul RPE Puffer, um die Spin-Säule.</li><li> Transfer der Spin-Säule in ein neues Sammelgefäß und führen Sie eine Spalte "Trocknen" Spin bei voller Geschwindigkeit für 2 Minuten.</li><li> Label einen neuen 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Ihrer Kennung. Übertragen Sie die Spin-Säule, um dieses Rohr.</li><li> Pipet 30 mu l RNase-freies Wasser auf die Mitte RNeasy Silica-Membran und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Minute. Schließen Sie die Tube und zentrifugieren Sie für 1 Minute bei voller Geschwindigkeit.</li><li> Vorsichtig Transfer der 30 ul, dass in den 1,7-ml-Tube gewonnen wird wieder auf die Mitte des RNeasy Silica-Membran aus dem gleichen Spin-Säule. Legen Sie die Spalte wieder in den gleichen 1,7 ml Sammel-Tube und Inkubation für 1 Minute bei Raumtemperatur. Säule für 1 Minute bei voller Geschwindigkeit. Diese Doppel-Elution wird sichergestellt, dass die maximale Menge an cRNA aus der Membran gewonnen wird.</li><li> Transfer dieser sauberen Biotin-markierten cRNA zu einem neuen 1,7 ml Zentrifugenröhrchen und Label angemessen.</li><li> Bestimmen Sie die cRNA-Konzentration mit dem gleichen Verfahren wie oben bei der RNA-Isolierung Verfahren skizziert. Notieren Sie sich die Konzentration und 260/280 Ratio.</li></ol><p class="jove_title"> 8. Fragmentierung der cRNA für Zielpräparation</p><ol><li> Label ein 0,5 ml PCR-Röhrchen mit Ihrer Kennung. Transfer-5 ug der äquivalenten Menge an cRNA mit dem Rohr. Fügen Sie genug RNase-freiem Wasser auf das Gesamtvolumen auf 16,0 ul zu bringen, und dann um 4,0 ul 5X Fragmentierung Puffer in die Röhre. Das Gesamtvolumen in der Röhre sollte 20,0 ul werden.</li><li> Vortex das Röhrchen und zentrifugieren Sie für 10 Sekunden. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 94 ° C für 30 Minuten in einem Thermocycler. Auf Eis gelegt nach der Inkubation.</li></ol><p class="jove_title"> 9. Die Beurteilung der fragmentierten und nicht fragmentierte cRNA mit Agarose Gel</p><ol><li> Einrichten der E-Gel-Elektrophorese-Apparatur mit einer 1,2% vorgefertigten Agarosegel. Pre-run das Gel für 2 Minuten nach der Herstellung der Empfehlung</li><li> Add 14 ul Wasser in jede Vertiefung auf der E-Gel.</li><li> Add 2μl jeder Probe in jede Vertiefung und Pipette nach oben und unten, gut mischen. Analysieren Sie sowohl die fragmentierten und nicht fragmentierte cRNA jeder Probe. Am besten ist es, die Proben (fragmentiert und nicht fragmentierte) in benachbarten Gassen laden. Notieren Sie sich die Identität der einzelnen Proben in jeder Spur.</li><li> Add 4 ul einer DNA-Leiter (BioLine Einfache Ladder I Größe Standard oder Novagen PCR-Marker) auf eine Spur des Gels</li><li> Führen Sie das Gel für 20 Minuten.</li><li> Visualisieren Sie die E-Gel auf einem Transilluminator. Werfen Sie einen Gel-Bild.</li></ol><p class="jove_title"> 10. Hybridisierung der Hefe 2,0 GeneChip</p><p class="jove_step"> Repräsentative Ergebnisse:</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Abbildung 1.</strong> Eine eingescannte Affymetrix GeneChip Hefe Bild (Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Abbildung 2.</strong> 2D-Punktdiagramm aller genetischen Transkripte (~ 6.700 Gene), den Vergleich eines Kontroll-und behandelten Hefe-Daten. Jeder Punkt repräsentiert ein einzelnes Gen. Genes in lilafarbenen zeigen Gene, die differentiell exprimiert werden, während Gene in roten nicht. Beschreibungen für die differentiell exprimierten Gene sind in der entsprechenden Legende bezeichnet und die meisten sind in die Kontrolle des Zellzyklus in diesem Beispiel beteiligt. (Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig3.jpg" alt="Figure 3" ><strong> Abbildung 3.</strong> Das Flussdiagramm zeigt, differentiell exprimierten Gene in einem betroffenen biologischen Wegs. Die Gene, die mit einem roten Stern gekennzeichnet zeigen die down-regulierten Gene in der meiotischen Weg. (Die Datenbank für Annotation, Visualisierung und Integrierte Discovery (DAVID)</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig4.jpg" alt="Figure 4" ><strong> Abbildung 4.</strong> Repräsentative Ergebnisse einer Volcano Plot. Kontroll-und behandelten Proben wurden mit einem p-Wert off von .05 geschnitten und ein 1,5 fach Ausdruck zu ändern abgeschnitten verglichen. Dieses Grundstück wurde mit Hilfe Geospiza ist GeneSifter Software freundlicherweise an die Studenten für pädagogische Zwecke gespendet.</p>

Discussion

<p class="jove_step"> Anwendungen und Bedeutung.</p><p class="jove_content"> The Vermont Genetics Netzwerk Outreach-Programm, an der University of Vermont, führt Bachelor-Reichweite bis acht Partner Abitur Colleges im ganzen Land. Das Ziel des VGN Outreach Core ist für Studenten in den Staat Vermont aussetzen state-of-the-art wissenschaftliche Technologie und Ressourcen mit praktischen Erfahrungen. Die Microarray-Modul beschrieben, wurde im Jahr 2003 entwickelt und anschließend ausgebaut werden. Es wurde als ein Mini-Kurs angeboten wurde oder integriert in bestehende Labor Lehrplans an den teilnehmenden Institutionen.</p><p class="jove_content"> Das Projekt, zwischen Forschungsuniversität Kernen und Studenten Hochschulen, fördert Kooperationen in Lehre und Forschung. Microarray Reichweite im ganzen Staat hat Lehrplan erweitert und erstellt Forschungs-und Networking-Möglichkeiten für zentrale Einrichtungen, Dozenten und Studenten.</p><p class="jove_content"> Als Student Fakultät das Programm nehmen sie werden ermutigt, einzigartige Experimente vorausgesetzt, es gibt entsprechende Affymetrix GeneChips und Annotation zur Verfügung Design. Alle Informationen zu diesem Modul einschließlich der laboratory manual, Referenzen und PowerPoint-Präsentationen sind online verfügbar (Vermont Genetics Network, 2008).</p><p class="jove_step"> Kritische Schritte aus:</p><p class="jove_content"<em> Spheroplasting:</em> Es ist wichtig für eine erfolgreiche Spheroplasting unter dem Mikroskop beobachten. Die Verwendung von SDS ist sehr vorteilhaft, da sie die Hefe Schwellungen führt Sphäroide Ursachen. Es ist wichtig zu beobachten, dass die Sprosszellen Sphäroide Form als auch. Wenn teilweise Spheroplasting beobachtet wird, ist eine längere Behandlung mit Lyticase empfohlen.</p><p class="jove_content"<em> Pellet Reinigung:</em> Während der Fällungsreaktion und anschließende Ethanol Waschschritt ist es sehr einfach, die cDNA Pellet verlieren. Äußerste Sorgfalt und viel Liebe zum Pellet ist zwingend erforderlich.</p><p class="jove_content"<em> Die Anwendung des Wassers in die Mitte der Membran:</em> Während der RNA Elutionsschritt von der Membran, ist es wichtig, "spritzen" der 30 ul Wasser direkt ins Zentrum der Silica-Membran. Wenn dies nicht erreicht ist, kann die Spalte zentrifugiert und die daraus resultierenden Elutionsmittel kann auf die Silica-Membran wieder neu aufgetragen. Dies kann so oft wie nötig wiederholt werden.</p><p class="jove_step"> Änderungen und Produkt Auswechslungen:</p><ol><li> Alternative RNA clean-up Säulen ersetzt werden können. Beispiele sind die USB-prep Leichtigkeit und die Invitrogen Reine Link-RNA-Kit, und die Omega-RNA clean-up-Kit ein paar zu nennen.</li><li> Schizosaccharomyces pombe ist ein optionales Hefe. Die Affymetrix GeneChip enthält sowohl Genome auf dem gleichen Chip</li><li> Verschiedene Behandlungen und Zeiten verwendet werden. Dies kann auch medikamentöse Behandlungen, Temperatur-Behandlungen, Anti-Oxidantien, etc. Behandlungszeiten auch eingestellt werden kann.</li><li> DNase-Behandlung ist möglicherweise nicht erforderlich, da die beschriebenen Methoden beschäftigen die Verwendung eines Oligo (dT)-Primer werden.</li><li> Es ist nicht erforderlich, um eine doppelte Elution der RNA aus der Säule mit dem gleichen 30 ul-Aliquot durchzuführen. Einmal ist fast immer ausreichend. Dies wird empfohlen, um sicherzustellen, dass eine vollständige Genesung erreicht wird. Zusätzlich wird das Wasser verwendet werden, um die RNA aus der Säule zu eluieren kann vorgewärmt werden, um 65 ° C zur weiteren Verbesserung der Fähigkeit, RNA aus dem Silica-Säule zu erholen.</li><li> Viele Methoden zur Verfügung, um RNA zu quantifizieren. Die Eppendorf und Nanodrop haben nur für ihre Benutzerfreundlichkeit ausgewählt und getestet Genauigkeit.</li><li> Agarosegelelektrophorese viele unter Verwendung von Standard Laborgeräte werden. Die E-Gel ist nicht erforderlich, aber wünschenswert ist, weil es RNase frei ist und erfordert keine Gel Erstarrung Wartezeit.</li><li> Bestellinformationen für Produkte geliefert worden. Allerdings können viele allgemeine Reagenzien von verschiedenen Herstellern bestellt werden.</li><li> One Cycle cDNA Reagenzien können separat erworben werden, wenn dies kostengünstiger.</li><li> Es gibt noch andere Ziel-prep Methoden, aber wir fühlen uns dieser bietet mehr Lernmöglichkeiten für die Schüler.</li></ol>

Materials

General Laboratory Equipment	Company	Product number
Spetrophotometer
Thermocyler
Microcentrifuge
Vortex
Stir Plates (2)
P-10s pipettors
P-20’s pipettors:
P-200’s pipettors:
P-1000’s pipettors:
Camera and transilluminator
Supplies – recommended
E-Gel Apparatus	Invitrogen	G6000-08
E-Gels	Invitrogen	G6018-02
Axygen 1.7 ml. Clear	Krackler	383-MCT175C
Axygen 0.5 ml clear tubes	Krackler	383-MCT060C
Axygen 2ml capture tubes	Krackler	383-MCT200NC
boxes of P-10 ART tips:	CLP	BT10XL
Boxes of P-100 ART tips:	CLP	BT200
Boxes of P-20 ART Tips:	CLP	BT20
Boxes of P-1000 ART Tips:	CLP	BT1000
Yeast Chips
General Laboratory Supplies
25 ml sterile disposable pipets-
5ml sterile disposable pipets-
Microfuge tube racks
KimWipes:
Lab Coats
Stir Bars
Culture flasks
Innoculating loops
Sharpies
Gloves
Autoclave tape
Stirrer bars
Reagents
30% Hydrogen Peroxide	EMD Millipore	386790
HBSS without Ca, Mg, or dye	Sigma-Aldrich	H6648-100ml
Qiagen Rneasy Mini Kit:	Qiagen	74104
Qiagen DNase Kit:	Qiagen	79254
Rnase Remover	Denville Scientific	D1180
Harleco Alcohol 100%	EMD Millipore	65347
ENZO IVT Kit	ENZO	ENZ-42655-10
Lyticase: one bottle	VWR	IC19012310
Water, Cell Culture grade	EMD Millipore	4.86505
Yeast culture:	ATCC	18824
YPD broth powder	EMD Millipore	4.8504
D(+) Glucose, Anhydrous	EMD Millipore	346351
Sorbitol	EMD Millipore	56755
EDTA	EMD Millipore	4005
SDS solution, 20%	EMD Millipore	7990-OP
Pellet Paint	EMD Millipore	69049
PCI RNase DNase free (7 aliquots):	Fisher	AC32711-500
7.5M NH4OAc	Fisher	ICN1987 5980
Fragmentation Buffer (200 mM Tris-Acetate, pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA)
Trizma Base	Fiaher	50-899-90034
KOAc	Fisher	NC9757725
MgOA	Fisher	NC9681042
Loading Dye	Invitrogen	10482055
PCR Markers	EMD Millipore	69278-3
Phase Lock Gels	Fisher	FP2302820
One-Cycle cDNA Kit	Invitrogen	A10752-030
Includes;
E. coli DNA Pol
dNTP’s
T4 DNA Pol.
T-7 oligod(T)
0.5ml EDTA pH 8.0
First Strand Buffer
E. Coli RNaseH
Second Strand Buffer
E. Coli DNA ligase
SuperScript II
DTT